南華大學附屬第一醫(yī)院（4200）黃明菊 李卓

中南大學（410013）周應軍2

腫節(jié)風為金粟蘭科（Chloranthaceae）草珊瑚屬植物草珊瑚Sarcandra glabra（Thunb.）Nakai.的干燥全株，分布于我國長江流域以南各省。腫節(jié)風具有清熱涼血、活血消斑、祛風通絡等功效，臨床上主要用于治療惡性腫瘤、感染性疾病、口腔疾病、跌打損傷等癥[1][2][3][4]。我們的前期研究已從腫節(jié)風藥材的水提取液中分離并鑒定了23個單體成分，同時對腫節(jié)風抗氧化活性進行了初步研究，試驗結果表明，腫節(jié)風多酚類部位具有很強的抗氧化活性，而且由此部位分離得到的多種化學成分也具有很強的抗氧化活性[5][6][7][8][9]。

為進一步分析研究腫節(jié)風的化學成分組成及抗氧化活性，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）對腫節(jié)風多酚類部位進行了分析，通過與對照化合物比較（保留時間和紫外吸收圖譜），標定了HPLC圖譜上的14個主要的色譜峰，分析了7個不同省份腫節(jié)風藥材的HPLC色譜圖，試驗結果表明，各省份藥材的成分組成基本相同，成份組成主要有3種類型：咖啡酸衍生物、黃酮類和香豆素類，但圖譜上各主要色譜峰的峰面積差異較大。不同產地腫節(jié)風藥材均有抗氧化活性，但不同產地活性大小差異較大。HPLC圖譜總峰面積與抗氧化活性大小基本一致。現(xiàn)將我們的研究分析報告如下，以便為相關技術人員對腫節(jié)風藥材的質量控制與開發(fā)利用提供一個參考依據(jù)。

1 儀器、試劑與藥材

1.1 儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀，配置四元梯度泵，在線脫氣機、自動進樣器、DAD檢測器、Chemstation色譜工作站；BP210S型電子天平（德國Sartorius公司），Elx-800型酶標儀（美國Bio-Tek公司）。

1.2 試劑與藥材 乙腈為色譜純（TEDIA company），水為市售純凈水，丙酮（湖南師大化學試劑廠）、磷酸（汕頭市光華化學廠）、碳酸氫鈉（天津市巴斯夫化工廠）均為分析純，聚酰胺（浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠）。DPPH?（二苯代苦味酰基自由基）購于SIGMA公司；95%乙醇（分析純，購自天津博迪試劑公司）。對照化合物（經(jīng)HPLC檢測純度均大于90%），均為從腫節(jié)風中分離所得，并通過化學與波譜手段鑒定其結構。腫節(jié)風藥材7批，均從各產地購買。

2 方法

2.1 腫節(jié)風多酚類部位儲備液的制備 精密稱取腫節(jié)風藥材10.0g，加水250mL煎煮1小時后，加水補足失重，過濾，取續(xù)濾液200mL，并將其減壓濃縮至小體積，加水補足至20mL，加入丙酮60mL，搖勻，放置過夜。取上清液60mL，濃縮干，加水5mL使其溶解，通過已處理好的聚酰胺柱（30～60目，水裝柱，25mL），水洗脫2BV，棄去水洗脫液，0.5%碳酸氫鈉溶液洗脫5BV，收集洗脫液，用鹽酸調pH=5～6，蒸干，殘渣加10mL水溶解，作為儲備液。

2.2 腫節(jié)風多分類部位指紋圖譜研究

2.2.1 供試品溶液的制備

2.2.1.1 對照品溶液 稱取各對照品化合物適量，用50%甲醇配成約為0.5mg/mL的溶液，作為對照品溶液。

2.2.1.2 供試品溶液 取腫節(jié)風多酚類部位儲備液經(jīng)45μm濾膜過濾，作為供試品溶液待用。

2.2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.2.1 流動相的確定 參考相關文獻[10]，確定流動相系統(tǒng)為乙腈-磷酸-水，采用梯度洗脫，A相為乙腈，B相為0.1%的磷酸水溶液，經(jīng)比較多種梯度條件，最后確定梯度程序為：0～5min，5% A線性梯度至7.5% A；5～13min，線性梯度至10.0% A；13～25min，線性梯度至15% A；25～30min，線性梯度至17.5% A；30～40min，線性梯度保持17.5% A；40～45min，線性梯度至20%A；45～50min，線性梯度保持20% A；50～55min，線性梯度至80% A。在此條件下，各色譜峰分離度好，保留時間適中。

2.2.2.2 檢測波長和流速的確定 采用二極管陣列檢測器，得到在190～400nm各波長下的色譜圖，最后選定310nm作為檢測波長，并記錄190～400nm范圍內的紫外吸收圖。在310nm波長下，各共有色譜峰分離情況良好，且均有較大的吸收峰值。對0.5，0.7，1.0mL/min進行了考察，1.0mL/min條件下色譜峰的峰形與保留時間較好。

2.2.3 方法學考察

附圖 各產地腫節(jié)風的HPLC圖譜（A、B）

附圖A 腫節(jié)風藥材提取液（產地：湖南）

附圖B 對照品混合液

2.2.3.1 精密度試驗 取湖南藥材（批號：2006033008）制備供試品溶液，連續(xù)重復進樣5次，每次10μL，記錄各共有主要峰的保留時間和峰面積，結果顯示，各

共有主要峰的保留時間和峰面積的RSD均小于3%。

2.2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取精密度試驗下供試品溶液分別在0、6、12、18、24、48小時進樣分析，并同時記錄各共有主要峰的保留時間和峰面積，結果顯示，各共有主要峰的保留時間和峰面積的RSD均小于3%。

2.2.3.3 重現(xiàn)性試驗 取同一批湖南藥材（批號：2006033008）樣品5份，制備供試品溶液，在上述色譜條件下分析，并同時記錄各共有主要峰的保留時間和峰面積，結果顯示，各共有主要峰的保留時間和峰面積的RSD均小于3%。

2.2.4 樣品測定 按確定的色譜條件和測定方法，分別對7個供試品進行檢測，并同時記錄各樣品的色譜圖和紫外吸收圖；在相同的色譜條件下，記錄各對照化合物混合樣品的色譜圖和紫外吸收圖。

附表1 各樣品HPLC色譜圖主要成份峰面積及總峰面積

附表2 不同產地腫節(jié)風藥材對DPPH自由基清除率及IC50

2.3 抗氧化活性研究

2.3.1 供試品溶液的制備

2.3.1.1 樣品溶液 取儲備液1mL，分別用95%乙醇稀釋至相應的濃度梯度（相當于藥材6，2，0.6，0.2，0.06mg/mL）的樣品5份。

2.3.1.2 DPPH溶液 稱取DPPH適量，用95%乙醇配成2×10-4mol/L的溶液。

2.3.2 DPPH?自由基清除率的測定 分別量取上述供試品溶液與DPPH?溶液各100μL于96孔板中，每個濃度設4個復孔，在搖床上震搖2min，避光反應28min后用酶聯(lián)免疫儀在517nm下用95%乙醇調零測定吸光值。重復試驗3次。

3 結果與討論

3.1 各產地腫節(jié)風藥材的HPLC圖譜分析。色譜峰的歸屬：1：3，4-二羥基苯甲酸；2：結構待定；3：綠原酸；4：咖啡酸-4-O-奎寧酸；5：咖啡酸；6：丁香酸；7：咖啡酸-4-O-奎寧酸甲酯；8：咖啡酸-3-O-奎寧酸甲酯；9：異秦皮啶；10：新落新婦苷；11：槲皮素-3-Oα-D-葡萄糖醛酸；12：迷迭香酸-4-Oβ-D-葡萄糖；13：山萘酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸；14：迷迭香酸。

對比對照化合物色譜圖與各樣品HPLC圖譜上相應色譜峰中的保留時間和UV圖譜標定了的指紋圖譜上的14個特征色譜峰（見附圖A、B）。比較各產地藥材的HPLC圖譜，結果顯示，各樣品的HPLC圖譜顯示出，各產地腫節(jié)風藥材在整體上來說較為相似，主要的色譜峰組成基本一致，成分主要有3類，分別為咖啡酸衍生物、黃酮類和香豆素類。

HPLC圖譜提示不同產地的藥材在化學成分上存在的差異：①峰面積總和差異：各樣品HPLC圖譜的總峰面積大小差異顯著，其中，鋒面積最大的廣西藥材是鋒面積最小的貴州藥材的4.15倍（見附表1）。②特征峰差異：廣東產藥材新落新婦苷（峰10）的色譜峰較明顯，而其他產地藥材的HPLC圖譜中，新落新婦苷的色譜峰很微弱或者根本檢測不到。廣西產腫節(jié)風藥材中迷迭香酸（峰14）的峰面積明顯較其他產地的藥材高，是其他產地藥材的3.0～11.3倍。

3.2 腫節(jié)風多酚類部位的抗氧化活性 不同濃度的腫節(jié)風藥材提取液清除DPPH自由基的能力見附表2。由附表2可以看出，腫節(jié)風藥材具有很強的清除DPPH自由基的能力，在0.03～3mg/mL的濃度范圍內，隨著提取物濃度的增加，腫節(jié)風藥材對DPPH自由基的清除能力逐漸增強。

由附表2可知，各產地腫節(jié)風藥材均顯示了較好的抗氧化活性，但不同產地的藥材抗氧化活性存在有較大的差異。由于各產地的藥材處理方法一致，而且各藥材多酚類成分的組成基本相同，因此，各樣品的總峰面積可以粗略反映出其中多酚類含量的相對高低，結合附表1可發(fā)現(xiàn)，各產地腫節(jié)風總多酚類化合物總峰面積的大小與其抗氧化活性強弱基本一致，總峰面積較大的樣品抗氧化活性也較強。

本次研究表明，7個不同省份腫節(jié)風藥材多酚類化合物的成分組成基本相同，成份組成主要有3種類型：咖啡酸衍生物、黃酮類和香豆素類，但色譜圖譜上各主要色譜峰的峰面積差異較大。不同產地腫節(jié)風藥材均有抗氧活性，HPLC圖譜總峰面積與抗氧化活性大小基本一致，但不同產地活性大小差異較大，產生的這一差異可能是由于各產地藥材天然生長環(huán)境、加工及儲存等環(huán)節(jié)的不確定性，導致各產地藥材的化學成分和生物活性差異較大。因此，為避免上述可能的影響因素，建議對腫節(jié)風進行人工栽培種植，并固定加工儲存條件以穩(wěn)定原藥材的質量；企業(yè)在采購原藥材時應根據(jù)需要選擇合適產地的原料，固定產地，并對其指紋圖譜加以考察控制，以保證產品質量的均一性和穩(wěn)定性。

綜上所述，各企業(yè)在選擇藥材時，一定要針對企業(yè)本身具體的需要、各藥材本身的品質及有效成分的活性、各不同產地藥材的色譜圖比較情況等要素，謹慎地選擇適合自己企業(yè)需要的產地的藥材。