楊芳， 呂玲玲， 施溯筠

（延邊大學(xué)長白山生物資源與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 延吉133002）

YANG Fang， LU Ling－ling， SHI Su－yun＊

（Key Laboratory for Natural Resource of Changbai Mountain ＆Functional Molecules（Yanbian University），Ministry of Education，Yanji 133002，China）

榆黃蘑可溶性蛋白的提取及其對羥自由基的清除作用

楊芳， 呂玲玲， 施溯筠＊

（延邊大學(xué)長白山生物資源與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 延吉133002）

對榆黃蘑可溶性蛋白的提取工藝進(jìn)行了研究．首先以蒸餾水、HCl、NaCl、NaOH和磷酸緩沖液等為溶劑，考察了不同提取液對榆黃蘑可溶性蛋白提取率的影響；然后通過單因素實(shí)驗(yàn)分別探討了提取液濃度、提取時(shí)間、料液比和提取溫度對榆黃蘑可溶性蛋白提取率的影響，并采用正交實(shí)驗(yàn)組合設(shè)計(jì)進(jìn)一步確定了榆黃蘑可溶性蛋白的最佳提取條件：提取液NaOH的濃度為0．075 mol/L，料液比為1∶40，提取溫度為50℃，提取時(shí)間為2 h，在此條件下的提取率為28．14 g/100 g（榆黃蘑粉）．最后采用鄰二氮菲－Fe氧化法測定了榆黃蘑可溶性蛋白對羥自由基的清除作用，發(fā)現(xiàn)榆黃蘑可溶性蛋白對羥自由基有較好的清除作用．

榆黃蘑；可溶性蛋白；提?。涣u自由基

0 引言

榆黃蘑（Pleurotus citrinopileatus Sing）是一種可食用菌，屬擔(dān)子菌亞門，傘菌目，側(cè)耳科，側(cè)耳屬，是長白山著名的藥食兩用真菌［1］．研究表明［2］，榆黃蘑干燥子實(shí)體富含多種氨基酸和微量元素，并有豐富的人體所必需的蛋白質(zhì)和氨基酸，其中蛋白質(zhì)含量高達(dá)41．5%．劉曉峰等人［3］從榆黃蘑中分離出尿嘧啶、β－吡啶甲酸、D－甘露醇、延胡索酸、油酸、麥角甾醇等活性成分．文獻(xiàn)［4－7］研究表明，榆黃蘑的多糖具有抗腫瘤、抗遺傳毒性、降脂、降血糖、提高免疫力的活性成分．Anthiny等［8］研究發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白具有降低膽固醇含量、預(yù)防心血管疾病、緩解骨質(zhì)疏松癥和改善更年期癥狀等作用．易翠平等［9］研究發(fā)現(xiàn)，大米蛋白含有豐富的賴氨酸，必需氨基酸含量接近FAO/WHO建議模式（1973），是禾谷類糧食中最好的一種蛋白質(zhì)．Fujita等［10］分離出一種鰹魚多肽（含LLPNM序列），其對高血壓患者具有降血壓作用，且無副作用．Cui等［11］從榆黃蘑的新鮮子實(shí)體提取液中分離純化出一種堿性蛋白酶，其在K2＋和Li2＋離子中具有較高的活性，但其活性受到Al3＋、Cu2＋、Hg2＋離子的抑制．本文采用超聲提取榆黃蘑中蛋白質(zhì)，通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)探討提取液、提取液濃度、提取時(shí)間、料液比和提取溫度對榆黃蘑可溶性蛋白提取率的影響，并研究榆黃蘑可溶性蛋白對羥自由基的清除作用，為榆黃蘑產(chǎn)品的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)．

1 試藥與儀器

鄰二氮菲和牛血清蛋白購自Sigma公司，考馬斯亮藍(lán)、NaOH、K2HPO4·3 H2O、KH2PO4、NaCl、濃鹽酸等皆為分析純．榆黃蘑購買于吉林省延吉市西市場，經(jīng)60℃干燥48 h后粉碎，過60目篩，得榆黃蘑粉．儀器有：U－1900紫外分光光度計(jì)（Hitachi High－Technologies Corporation，Japan）；FDU－2200冷凍干燥機(jī)（Tokyo Rikakikai CO．，Ltd．，Japan）；DHG－9146A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）．

2 方法與結(jié)果

2．1 蛋白含量的測定

蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)G－250法，用標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白做標(biāo)準(zhǔn)品，于595 nm處檢測吸光度值，Y＝11．468 X＋0．000 9，相關(guān)系數(shù)R2＝0．999 1．

2．2 不同提取溶劑對蛋白提取率的影響

稱取2 g榆黃蘑粉5份，分別以蒸餾水、HCl（0．05 mol/L，p H＝2．5）、磷酸緩沖液（PBS，0．2 mol/L，p H＝8．0）、NaOH（0．1 mol/L）、NaCl（0．5 mol/L）等為溶劑，超聲提取5 min（功率為100 Hz）；于50℃下浸提7 h（料液比為1∶30），所得產(chǎn)物過濾除去沉渣，然后用考馬斯亮藍(lán)法測上清液中的蛋白含量．由圖1可知，各提取溶劑的提取效果依次為Na OH＞HCl＞PBS＞水＞NaCl．堿液的提取效果最佳表明榆黃蘑中酸性蛋白最多．

圖1 不同提取溶劑對榆黃蘑可溶性蛋白提取的效果

2．3 單因素試驗(yàn)

2．3．1 堿液濃度對蛋白提取率的影響 稱取2 g榆黃蘑粉5份，分別加入不同濃度的NaOH溶液80 m L（0．012 5、0．025、0．05、0．075、0．1、0．125、0．15 mol/L），混勻后超聲5 min；于50℃ 浸提6 h，產(chǎn)物過濾后取上清液測定蛋白含量．由圖2可知，NaOH的濃度對提取率的影響較大，當(dāng)NaOH的濃度為0．05 mol/L時(shí)，榆黃蘑蛋白的提取率達(dá)到16．24%，隨著Na OH濃度的增加，提取率沒有明顯增加，所以NaOH的濃度選擇為0．05 mol/L．

圖2 不同濃度的NaOH對榆黃蘑可溶性蛋白提取率的影響

2．3．2 提取時(shí)間對蛋白提取率的影響 稱取2 g榆黃蘑粉5份，分別加入80 m L（0．05 mol/L）NaOH溶液，混勻后超聲5 min；于50℃分別浸提0．5、1、2、3、4、5 h，產(chǎn)物過濾后取上清液測定蛋白含量．由圖3可知，提取3 h的蛋白提取率最高．

圖3 提取時(shí)間對榆黃蘑可溶性蛋白提取率的影響

2．3．3 料液比對蛋白提取率的影響 稱取2 g榆黃蘑粉5份，分別加入0．05 mol/L NaOH溶液20、40、60、80、100 m L，混勻后超聲5 min；于50℃浸提2 h，產(chǎn)物過濾后取上清液測定蛋白含量．由圖4可知，當(dāng)料液比為1∶40時(shí)蛋白提取率最高．

圖4 料液比對榆黃蘑可溶性蛋白提取率的影響

2．3．4 提取溫度對蛋白提取率的影響 稱取2 g榆黃蘑粉，加入80 m L（0．05 mol/L）NaOH溶液，混勻后超聲5 min；分別于30、40、50、60、70℃水浴提取3 h，產(chǎn)物過濾后取上清液測定蛋白含量．由圖5可知，提取溫度對提取效果的影響較大，提取溫度為60℃時(shí)提取率最高．鑒于蛋白質(zhì)的熱不穩(wěn)定性以及工藝成本，且50℃時(shí)的提取率也相對較高，故最適溫度選擇為50℃．

圖5 提取溫度對榆黃蘑可溶性蛋白提取率的影響

2．4 正交實(shí)驗(yàn)

采用正交表L9（34）做正交試驗(yàn)，通過組合設(shè)計(jì)考察了提取體系中提取溫度、料液比、堿液濃度以及提取時(shí)間對榆黃蘑中蛋白提取率的影響，并以此確定最佳的提取工藝條件，詳見表1．

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

由表2可知，除提取時(shí)間外，提取溫度、堿液濃度和料液比都對蛋白的提取率有較大的影響．4個(gè)因素對榆黃蘑蛋白提取的影響程度為A＞C＞B＞D．由極差分析可知，A2B2C3D1為最佳組合，即在提取時(shí)間為2 h、提取溫度為50℃、料液比為1∶40、NaOH的濃度為0．075 mol/L的條件下，可溶性蛋白的提取率為28．14 g/100 g．

表2 提取榆黃蘑中蛋白的L9（34）正交試驗(yàn)

2．5 清除羥自由基的測定

按照2．4中的最佳方法提取榆黃蘑可溶性蛋白，并用冷凍干燥法將其制備成干粉．用0．075 mol/L的NaOH溶液分別將干粉制成1、2、3、4、5、6 mg/m L的溶液，并以Vc為對照，采用鄰二氮菲－Fe氧化法［12］測定其對羥自由基的清除作用．由圖6可知，榆黃蘑的可溶性蛋白對羥自由基具有較好的清除作用，且隨著蛋白質(zhì)量濃度的增加其效果更加明顯，蛋白濃度為6 mg/m L時(shí)，對羥自由基的清除率達(dá)94．5%，接近Vc（相近濃度）的清除水平．

圖6 不同濃度的榆黃蘑可溶性蛋白對羥自由基的清除作用

3 結(jié)論

不同材料的蛋白其提取方法也不同，一般水溶性蛋白的提取采用水提、稀酸、稀堿、稀鹽、緩沖液等．影響蛋白質(zhì)提取率的因素有很多，如溫度、溶液的p H值、提取時(shí)間、料液比、離子強(qiáng)度等．本實(shí)驗(yàn)選擇了溶劑濃度、提取溫度、料液比和提取時(shí)間來研究其對榆黃磨蛋白提取率的影響．結(jié)果顯示：榆黃蘑可溶性蛋白的最佳提取條件為A2B2C3D1，即提取時(shí)間為2 h，提取溫度為50℃，料液比為1∶40，NaOH濃度為0．075 mol/L．由于榆黃蘑屬真菌類，考慮其細(xì)胞壁對蛋白溶出的影響，本實(shí)驗(yàn)選擇了超聲破壁和渦旋混勻的輔助手段來提高了提取效率．

另外，本文的前期實(shí)驗(yàn)表明，榆黃蘑具有較強(qiáng)的抗氧化性，且鮮品比干品的抗氧化性更高，這可能是因?yàn)橐恍┛寡趸镔|(zhì)在干燥過程中喪失了活性，如蛋白質(zhì)等［13］．本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了榆黃蘑可溶性蛋白具有較強(qiáng)的清除羥自由基的作用，其功能有待進(jìn)一步研究．

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Extracting technology of soluble protein of Pleurotus citrinopileatus and its antioxidant activities on hydroxyl radicals

Extracting technology of soluble protein of Pleurotus citrinopileatus are resarch on different solution of distilled water，HCl，NaCl，NaOH and phosphate buffer solution．And that study the single factor experiment and the orthogonal experimental design on extraction solution concentration，time，ratio of material to liquid，extraction time and temperature．The results show that the optimum extraction process are extraction time 2 h，extraction temperature of 50℃，solid－liquid ratio 1∶40，NaOH concentration of 0．075 mol/L，and under this condition soluble protein extraction rate is 28．14 g/100 g（Pleurotus citrinopileatus powder）．Further，we discovere the Pleurotus citrinopileatus soluble protein have better removal effect on·OH．

Pleurotus citrinopileatus；soluble protein；extraction；·OH

R285．5；S646．9；TS201．2

A

1004－4353（2012）02－0142－04

YANG Fang， LU Ling－ling， SHI Su－yun＊

（Key Laboratory for Natural Resource of Changbai Mountain ＆Functional Molecules（Yanbian University），Ministry of Education，Yanji 133002，China）

2012－02－15

＊通信作者：施溯筠（1972—），女，博士，副教授，研究方向?yàn)樘烊簧镔Y源的開發(fā)與活性成分研究．