陳瑩 常志文 翟艷苓 張勇 楊琳 林文娟

抑郁癥在冠心病患者中頗為常見(jiàn)［1］，已有許多文獻(xiàn)報(bào)道抑郁癥對(duì)冠心病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有負(fù)面影響。早在20世紀(jì)30年代，就有醫(yī)師觀察到抑郁癥患者(當(dāng)時(shí)叫憂(yōu)郁癥melancholia)死于心血管疾病的比例高于常人。近年來(lái)對(duì)于抑郁癥影響動(dòng)脈粥樣硬化形成的機(jī)制越來(lái)越多地成為基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)，部分學(xué)者提出抑郁障礙通過(guò)炎癥反應(yīng)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展，然而有關(guān)抑郁障礙與炎性標(biāo)記物相關(guān)性的資料報(bào)道較少，且觀點(diǎn)不一致［2-4］。核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)的激活是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)機(jī)制之一，本研究探討抑郁障礙是否通過(guò)啟動(dòng)NF-κB表達(dá)來(lái)促進(jìn)冠心病的發(fā)生發(fā)展，以及抗抑郁治療阻斷NF-κB表達(dá)能否為臨床治療冠心病開(kāi)辟新的途徑。

1 材料和方法

1.1 主要藥品和試劑

氟西汀和丙咪嗪(Sigma公司)，血清高敏C反應(yīng)蛋白(hypersensitive C-reaction protein，hsCRP)檢測(cè)試劑(上海基恩科技有限公司)，血清單核細(xì)胞趨化 因 子 1(monocyte chemoattractantprotein-1，MCP-1)檢測(cè)試劑(RB公司)，鼠抗人NF-κB p65單克隆抗體、山羊抗鼠MCP-1多克隆抗體，兔抗人κB抑制蛋白(inhibitory kappa B，IκB)多克隆抗體，Actin內(nèi)參(Santa Cruz Biotechnology)。

1.2 動(dòng)物分組、模型復(fù)制及給藥方案

雄性SD大鼠50只，平均體質(zhì)量(175±24)g，2.5月齡，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào) SCXK(京)20050003。于 24℃、12/12 h 光照/黑暗交替實(shí)驗(yàn)環(huán)境飼養(yǎng)，正常飲食，適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境1周后，隨機(jī)抽簽分為5組，每組10只:CS組為對(duì)照組，又給予生理鹽水腹腔注射;CI組也為對(duì)照組，給予丙咪嗪10 mg/kg腹腔注射;SS組為游泳應(yīng)激組，給予生理鹽水腹腔注射;SF組為氟西汀干預(yù)組，游泳應(yīng)激同時(shí)給予氟西汀10 mg/kg腹腔注射;SI組為丙咪嗪干預(yù)組，游泳應(yīng)激同時(shí)給予丙米嗪10 mg/kg腹腔注射。行為絕望大鼠模型參照文獻(xiàn)［5］并加以改進(jìn)。具體方法如下:每日不定時(shí)將大鼠置于水溫10℃、水深為30 cm的水池(2.0 m×1.0 m×1.5 m)中強(qiáng)迫其游泳，連續(xù)21 d，每日1次，每次1只，強(qiáng)迫游泳時(shí)間為每次5 min。游泳結(jié)束后迅速用干毛巾、吹風(fēng)機(jī)將游泳大鼠皮毛擦干，然后放回籠中。

1.3 行為學(xué)觀察指標(biāo)

(1)open-field曠場(chǎng):觀察大鼠水平移動(dòng)距離、直立動(dòng)作、探究行為、修飾動(dòng)作和排泄行為。(2)基礎(chǔ)糖水/純水消耗試驗(yàn):計(jì)算大鼠的糖水消耗、純水消耗、總液體消耗、糖水偏愛(ài)(糖水偏愛(ài)=糖水消耗/總液體消耗×100%)。(3)體質(zhì)量變化:觀察體質(zhì)量增長(zhǎng)量的變化。

1.4 大鼠外周血hsCRP、MCP-1含量測(cè)定

應(yīng)激結(jié)束后48 h內(nèi)，將大鼠斷頭處死，應(yīng)用不含抗凝劑真空采血管采集血液3 ml，離心提取上清液，－80℃低溫冰箱保存。血清MCP-1檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫夾心法(ELISA)，并用自動(dòng)酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)490 nm)分析結(jié)果。

1.5 大鼠血管組織MCP-1、NF-κB p65檢測(cè)

分離胸主動(dòng)脈，留取主動(dòng)脈弓向下1 cm處血管組織置于10%中性甲醛溶液中固定待檢，另留取血管組織置于－80℃低溫冰箱凍存待檢。石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片、脫蠟、入水，3%H2O2去離子水室溫孵育5 min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，抗原修復(fù)，滴加適當(dāng)比例兔來(lái)源一抗，4℃冰箱過(guò)夜，PBS沖洗，滴加山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體，室溫孵育30 min，PBS沖洗，DAB顯色，脫水、透明、封片、鏡檢，應(yīng)用真彩色醫(yī)學(xué)圖像分析軟件(Image Pro Plus 5.0，Midia Cybemetics公司)對(duì) MCP-1、NF-κB p65 表達(dá)結(jié)果進(jìn)行半定量分析，比較MCP-1、NF-κB p65在不同組間陽(yáng)性表達(dá)的平均面積。

1.6 大鼠血管組織 NF-κB p65、MCP-1、IκB-α 檢測(cè)

蛋白電泳應(yīng)用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 應(yīng)激前后各組大鼠體質(zhì)量和行為學(xué)指標(biāo)變化

游泳應(yīng)激前各組大鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，行為學(xué)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示各組大鼠應(yīng)激前在體質(zhì)量、行為上大致相同。

游泳應(yīng)激后各組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)不同(P=0.001)，SS組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)最低，CS組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)最快，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中8只大鼠死亡。

游泳應(yīng)激后行為學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果中，各組間也存在不同程度的差異，其中水平活動(dòng)距離檢測(cè)中，SS組和SF組大鼠水平活動(dòng)距離最短，CS組和CI組大鼠水平活動(dòng)距離最長(zhǎng)(P=0.004);直立動(dòng)作和探究行為檢測(cè)中，SS組、SF組和SI組大鼠得分最低，CS組和CI組大鼠得分最高(P=0.000和P=0.000);修飾動(dòng)作和排泄次數(shù)檢測(cè)中，SS組大鼠得分最高，CS組、CI組、SF組和SI組大鼠得分均明顯低于SS組(P=0.001和P=0.014)(表1)。

2.2 應(yīng)激對(duì)各組大鼠液體消耗的影響

應(yīng)激前各組大鼠基線糖水消耗、純水消耗、總液體消耗和糖水偏愛(ài)百分比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

游泳應(yīng)激21 d后，SS組的糖水消耗和糖水偏愛(ài)百分比都顯著低于CS組、CI組和SF組，而純水消耗量則顯著高于CS組、CI組和SF組，總液體消耗各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SI組糖水消耗介于SS組和CS組之間，與兩組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，糖水偏愛(ài)百分比與SS組相同，而顯著低于CS組、CI組和SF組，純水消耗量也與SS組相同，而顯著高于CS組、CI組和SF組，總液體消耗與各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

2.3 應(yīng)激后各組大鼠外周血hsCRP和MCP-1含量

游泳應(yīng)激后各組大鼠外周血hsCRP和MCP-1含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004，P=0.000)，SS組大鼠外周血hsCRP和MCP-1含量明顯高于CS和CI組(表3)。

2.4 免疫組化法檢測(cè)應(yīng)激后各組大鼠MCP-1和NF-κB p65 表達(dá)

SS組大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞MCP-1呈陽(yáng)性表達(dá)，為環(huán)繞胞膜及胞漿內(nèi)棕黃色顆粒，且陽(yáng)性表達(dá)的平均面積顯著高于CS和CI組(P＜0.05)。SI組也可看到部分血管內(nèi)皮細(xì)胞MCP-1呈陽(yáng)性表達(dá)，但與CS和CI組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NF-κB活化后即發(fā)生核轉(zhuǎn)位，由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞核，SS組大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB呈陽(yáng)性表達(dá)，為胞核濃染棕黃色顆粒，陽(yáng)性表達(dá)的平均面積顯著高于CS和 CI組(P＜0.05)(表4，圖1～2)。

2.5 蛋白印跡法檢測(cè)應(yīng)激后各組大鼠MCP-1和NF-κB p65/IκB-α 表達(dá)

檢測(cè)大鼠血管組織細(xì)胞MCP-1、NF-κB p65水平，CS組和CI組大鼠血管組織細(xì)胞MCP-1幾乎無(wú)表達(dá)，SS組、SI組和 SF組大鼠血管組織細(xì)胞MCP-1、NF-κB p65表達(dá)水平明顯上調(diào)。胞漿中IκB-α 表達(dá)顯著減少(表5)。

表1 應(yīng)激后各組大鼠行為學(xué)指標(biāo)()

表1 應(yīng)激后各組大鼠行為學(xué)指標(biāo)()

注:與CS組比較，aP＜0.05;SS組與SF組或SI組比較，bP＜0.05

?

表2 應(yīng)激后各組大鼠液體消耗實(shí)驗(yàn)()

表2 應(yīng)激后各組大鼠液體消耗實(shí)驗(yàn)()

注:與CS組比較，aP＜0.01;SS組或SF組與SI組比較，bP＜0.01;SF組與SI組比較，cP＜0.01

?

表3 應(yīng)激后各組大鼠外周血hsCRP和MCP-1水平()

表3 應(yīng)激后各組大鼠外周血hsCRP和MCP-1水平()

注:與CS組比較，aP＜0.01

組別 只數(shù) hsCRP(mg/L) MCP-1(ng/L)CS 10 0.15±0.06 22.52± 8.45 CI 7 0.12±0.04 21.42± 6.75 SS 9 0.26±0.07a 52.02±18.83a SF 8 0.21±0.07a 29.68±10.03 SI 8 0.20±0.07a 31.33±12.00 P值0.001 0.000

表4 應(yīng)激后各組大鼠血管組織MCP-1和NF-κB p65表達(dá)()

表4 應(yīng)激后各組大鼠血管組織MCP-1和NF-κB p65表達(dá)()

注:與CS組比較，aP＜0.05

組別 只數(shù) MCP-1 NF-κB p65 CS 10 25.3±6.1 20.2±5.6 CI 7 25.1±5.0 18.6±5.6 SS 9 35.6±7.5a 31.2±6.5a SF 8 26.6±5.1 25.4±4.4a SI 8 28.0±5.7 23.1±6.2

表5 Western blot檢測(cè)各組大鼠血管組織MCP-1、NF-κB p65、IκB-α表達(dá)()

表5 Western blot檢測(cè)各組大鼠血管組織MCP-1、NF-κB p65、IκB-α表達(dá)()

注:與CS組比較，aP＜0.013

組別 只數(shù) MCP-1(IKBA值)NF-κB p65(IKBA值)IκB-α(IKBA值)CS 10 0.85±0.15 0.12±0.04 2.07±0.48 CI 7 0.76±0.08 0.11±0.05 2.03±0.36 SS 9 1.78±0.36a 0.88±0.16a 0.48±0.07a SF 8 1.51±0.23a 1.01±0.23a 1.95±0.47 SI 8 1.76±0.36a 0.91±0.12a 0.45±0.19a P值0.000 0.000 0.000

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病的病理基礎(chǔ)，炎癥又是動(dòng)脈粥樣硬化的基本特征。大量研究表明，冠心病的發(fā)生發(fā)展與炎癥密切相關(guān)［6-8］。抑郁癥患者體內(nèi)炎性標(biāo)記物水平的變化是近幾年來(lái)各國(guó)學(xué)者新的發(fā)現(xiàn)，那么抑郁癥和炎癥反應(yīng)誰(shuí)起始動(dòng)作用，各國(guó)學(xué)者們均做了進(jìn)一步研究［9］。冠心病患者中抑郁障礙頗為常見(jiàn)，因此部分學(xué)者提出抑郁障礙通過(guò)炎癥反應(yīng)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，游泳應(yīng)激組大鼠不僅外周血炎性標(biāo)記物水平增高，而且血管壁炎性標(biāo)志物NF-κB p65和MCP-1呈陽(yáng)性表達(dá)，NF-κB p65和MCP-1蛋白水平增高，提示抑郁模型建立過(guò)程中啟動(dòng)了炎癥反應(yīng)。

MCP-1基因啟動(dòng)子中含有 NF-κB結(jié)合位點(diǎn)，NF-κB是轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員，主要由p50和p65二亞基所組成。細(xì)胞靜息狀態(tài)下，NF-κB與其抑制因子IκB相結(jié)合，使NF-κB以無(wú)活性的形式存在于胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞受到各種刺激后，IκB發(fā)生快速泛蛋白化及蛋白酶解，NF-κB即被活化，并很快易位到核中，與靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域κB基序結(jié)合，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白合成。作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB對(duì)多種促炎癥細(xì)胞因子、黏附分子、趨化因子和生長(zhǎng)因子等的表達(dá)起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。NF-κB參與炎癥過(guò)程中的多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑，并且在動(dòng)脈粥樣硬化晚期參與平滑肌細(xì)胞增殖的生長(zhǎng)因子亦由NF-κB調(diào)控，因而認(rèn)為NF-κB的激活是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，應(yīng)激組大鼠血管組織中NF-κB p65和MCP-1表達(dá)均增強(qiáng)，血管組織胞漿中 IκB-α 表達(dá)下降，表明NF-κB p65核轉(zhuǎn)位是由 NF-κB 的抑制因子 IκB 降解所致，提示NF-κB/IκB信號(hào)通路可能介導(dǎo)了大鼠血管組織MCP-1表達(dá)，活化的NF-κB p65可能通過(guò)促進(jìn)MCP-1表達(dá)而誘導(dǎo)單核細(xì)胞黏附于血管壁并穿入內(nèi)皮下吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞，形成動(dòng)脈粥樣硬化早期病理改變。

抑郁癥屬于情感性精神障礙性疾病，是一種以顯著而持久的心境低落為主要特征的綜合征。本研究對(duì)21 d強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)后的大鼠進(jìn)行了相關(guān)行為學(xué)測(cè)試，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SS組大鼠open-field曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)得分，包括水平移動(dòng)距離、直立動(dòng)作和探究行為，以及體質(zhì)量增長(zhǎng)均低于正常對(duì)照組，而修飾動(dòng)作和排泄行為均高于正常對(duì)照組，反映出游泳應(yīng)激組大鼠處于抑郁情緒狀態(tài)，在行為學(xué)方面表明了該模型的成功建立。

本研究選用傳統(tǒng)三環(huán)類(lèi)抗抑郁藥物丙咪嗪和目前臨床上常用的抗抑郁劑選擇性5-HT重?cái)z取抑制劑氟西汀，對(duì)比藥物干預(yù)組大鼠與對(duì)照組在炎性標(biāo)記物方面的差異，分析藥物干預(yù)對(duì)于上述檢測(cè)指標(biāo)的影響效果。研究結(jié)果提示抗抑郁劑均發(fā)揮了一定抗抑郁療效，外周血炎性標(biāo)記物含量檢測(cè)和應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色、Western印跡檢測(cè)結(jié)果提示，抗抑郁藥的應(yīng)用可不同程度地減少大鼠外周血炎性標(biāo)記物含量，下一步的研究應(yīng)設(shè)定不同藥物劑量及增加觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)，進(jìn)一步明確抗抑郁治療對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的影響。

本研究結(jié)果表明抑郁障礙通過(guò)啟動(dòng)炎癥因子NF-κB表達(dá)，在冠心病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用，抗抑郁治療可改善抑郁相關(guān)癥狀并可能通過(guò)降低外周血、血管組織炎性標(biāo)記物水平，為冠心病治療提供了新思路。

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