壽佳菲，潘麗軍,2,*，操麗麗,2，劉 模

(1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點實驗室，安徽 合肥 230009)

酶催化菜籽油酸解制備結(jié)構(gòu)脂質(zhì)工藝

壽佳菲1，潘麗軍1,2,*，操麗麗1,2，劉 模1

(1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點實驗室，安徽 合肥 230009)

以菜籽油和辛酸為原料，用來自Thermomyces lanuginosa固定化脂肪酶TL IM作為催化劑，采用單因素試驗結(jié)合響應(yīng)曲面(Box-Behnken設(shè)計)優(yōu)化得到酶法制備結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的工藝條件，最佳制備條件為底物(菜籽油:辛酸)物質(zhì)的量比1:3.57、加酶量10.57%(以底物質(zhì)量計)、加水量5.2%(以酶質(zhì)量計)、反應(yīng)溫度48.6℃、反應(yīng)時間12h。該條件下辛酸插入率可達(dá)23.19%。對提高油菜籽油附加值、延長油菜加工產(chǎn)業(yè)鏈具有重要意義。

菜籽油；辛酸；酸解；結(jié)構(gòu)脂質(zhì)；響應(yīng)曲面

結(jié)構(gòu)脂質(zhì)(structured lipids)，是對甘油三酯和脂肪酸經(jīng)過改性或結(jié)構(gòu)調(diào)整得到的脂，將特殊營養(yǎng)或生理功能的脂肪酸結(jié)合到特定位置，在保留天然油脂的部分或全部性質(zhì)外，以最大限度發(fā)揮各種脂肪酸的功能，如能增強(qiáng)免疫力、易消化吸收、降低血脂、改善氮平衡、減少癌癥、心血管疾病、肥胖癥的患病風(fēng)險等等[1]。有研究表明，脂肪酸的種類及其在甘油骨架上的位置與代謝途徑密切相關(guān)。甘油三酯在體內(nèi)的代謝過程中脂肪酶只水解1,3位上的脂肪酸，而2位上的所有脂肪酸都以單甘酯的形式被吸收[2-4]。因此，1,3位是中(短)碳鏈脂肪酸、2位是長鏈脂肪酸的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的生產(chǎn)引起了國內(nèi)外廣泛關(guān)注。

結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的生產(chǎn)方法主要有物理法、化學(xué)催化法和酶合成法[5]。物理法是經(jīng)過簡單的調(diào)和或分餾來制取，但不能改變甘油三酯中脂肪酸的分布，因此不能得到所需的產(chǎn)品?；瘜W(xué)催化法一般以堿金屬為催化劑，反應(yīng)條件強(qiáng)烈、無特異性、產(chǎn)物難以分離、難以得到期望的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)[6]。而在酶法中，由于脂肪酶具有位置專一性和脂肪酸專一性，因此可避免上述兩種方法的缺點，并能在溫和的條件下，合成特定的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，且副產(chǎn)物少、產(chǎn)品易回收[6-7]。因此酶法合成結(jié)構(gòu)脂質(zhì)具有廣闊的應(yīng)用前景。本實驗以商品化1,3特異性脂肪酶TL IM(來自Thermomyces lanuginosa)作為催化劑，一級精煉菜籽油和辛酸為底物，采用單因素實驗結(jié)合響應(yīng)曲面(Box-Behnken設(shè)計)優(yōu)化酶催化酸解反應(yīng)，確定最佳反應(yīng)工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

一級精煉菜籽油 安徽省大平油脂廠；固定化脂肪酶 TL IM 丹麥諾維信公司；辛酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；豬胰脂肪酶 北京索萊寶科技有限公司；辛酸(98%) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；正己烷等其他試劑均為國產(chǎn)分析純或色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

SHY-2A型恒溫氣浴搖床 江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；AR1140/C型電子天平 奧豪斯(上海)公司；GC-2010氣相色譜儀 日本島津制作所；臺式高速冷凍離心機(jī) 美國Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 菜籽油與辛酸的酸解反應(yīng)

稱5.0g菜籽油和適量辛酸加入到50mL具塞錐形瓶中，加入一定量的固定化脂肪酶，在轉(zhuǎn)速150r/min、一定溫度條件下，密閉振蕩反應(yīng)。定時取樣，分離純化以及甲酯化后用于分析辛酸插入率。

1.3.2 產(chǎn)物分離純化方法[8]

將過濾除去脂肪酶的混合產(chǎn)物置于分液漏斗中，加入適量正己烷溶解，用1g/mL的酚酞溶液作為指示劑，加堿皂化除去游離脂肪酸，無水乙醇-水(80:20，V/V) 溶液和蒸餾水多次洗滌干燥后，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后即得產(chǎn)物。

1.3.3 甲酯化方法[9-10]

取分離純化后的產(chǎn)物1mL 溶于2mL的色譜純正己烷中，加入適量無水硫酸鈉干燥后，取上清液，加入400μL KOH-甲醇溶液(1mol/L)，用力搖晃1min后，加入適量蒸餾水靜置分層，取上清液用無水硫酸鈉干燥后用于分析。

1.3.4 色譜分析條件

色譜柱：DB-WAX 毛細(xì)管柱(30m×0.25mm，0.25μm)；FID檢測器，溫度250℃；進(jìn)樣口溫度230℃；升溫程序：60℃保持1 min，以50℃/min升至200℃，保持1min后，以3℃/min升至250℃，保留3min；氦氣流速30mL/min，進(jìn)樣量1μL；分流比50:1。

1.3.5 辛酸插入率的計算

以樣品峰的保留時間與辛酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間定性，按峰面積歸一法計算辛酸插入率。

1.3.6 單因素試驗

1.3.6.1 底物(菜籽油:辛酸)物質(zhì)的量比的影響

在無溶劑體系中，加酶量為10%(以底物質(zhì)量計)，加水量10%(以酶質(zhì)量計)，反應(yīng)溫度為50℃，轉(zhuǎn)速為150r/min，密閉反應(yīng)一段時間，制備結(jié)構(gòu)脂質(zhì)。考察不同底物物質(zhì)的量比(菜籽油:辛酸)對辛酸插入率的影響。

1.3.6.2 反應(yīng)溫度的影響

選取1.3.6.1節(jié)的最適底物物質(zhì)的量比，其他條件同

1.3.6.1節(jié)，考察不同反應(yīng)溫度對辛酸插入率的影響。

1.3.6.3 加酶量的影響

選取1.3.6.2節(jié)的最適反應(yīng)溫度，其他條件同1.3.6.2節(jié)，考察不同加酶量對辛酸插入率的影響。

1.3.6.4 加水量的影響

選取1.3.6.3節(jié)的最適加酶量，其他條件同1.3.6.3節(jié)，考察不同加水量對辛酸插入率的影響。

1.3.7 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用中心組合試驗Bo x-Behnken設(shè)計，因素及其水平如表1所示。

表1 酶法制備結(jié)構(gòu)脂質(zhì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of RSM

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 底物物質(zhì)的量比對辛酸插入率的影響

在脂肪酶催化酸解反應(yīng)中，反應(yīng)達(dá)到平衡后產(chǎn)物的組成與底物物質(zhì)的量比有密切關(guān)系。由圖1可知，底物物質(zhì)的量比(菜籽油:辛酸)為1:3時辛酸插入率相對較高，原因可能是高水平的游離脂肪酸會產(chǎn)生大量的羧酸基團(tuán)，從脂肪酶表面奪取部分必需水，而且可以從油水界面進(jìn)入到周圍的水層中，導(dǎo)致底物抑制效應(yīng)的發(fā)生[11]。

圖1 底物物質(zhì)的量比對辛酸插入率的影響Fig.1 Effect of substrate molar ratio on the incorporation rate of caprylic acid

2.1.2 反應(yīng)溫度對辛酸插入率的影響

酶催化酸解反應(yīng)時一個熱力學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)溫度的高低不僅影響底物的溶解狀態(tài)及黏度，而且影響底物在反應(yīng)體系中的傳質(zhì)[12]。另外，溫度也影響著酶的活性。由圖2可知，溫度越高，辛酸插入率越高。高溫有助于反應(yīng)底物的互溶，增加底物的接觸面積，加快反應(yīng)速度，縮短反應(yīng)時間[12]。但是溫度從40℃升高到50℃時，辛酸插入率增加很快，而50℃后增加趨勢放慢?？紤]到較高溫度對酶的活性影響很大，選擇反應(yīng)溫度為50℃左右較為合適。

圖2 反應(yīng)溫度對辛酸插入率的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on the incorporation rate of caprylic acid

2.1.3 加酶量對辛酸插入率的影響

圖3 加酶量對辛酸插入率的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on the incorporation rate of caprylic acid

圖3表明，隨著酶量的增加，辛酸插入率逐漸增大，但是到10%后，辛酸插入率增大得很緩慢，可能是隨著酶量的增加，底物與酶分子接觸的機(jī)會增多，加速了酸解反應(yīng)的進(jìn)行[13]。但是酸解反應(yīng)是復(fù)雜的可逆反應(yīng)，酶量的增加也加速了逆反應(yīng)的進(jìn)程和油脂水解反應(yīng)，同時，在無溶劑體系中，酶量的增加可能會提高體系的黏度，影響傳質(zhì)，同時也會加大成本。綜合考慮，適宜酶添加量為10%左右。

2.1.4 加水量對辛酸插入率的影響

脂肪酶只有在油-水界面才具有催化活性，因此水是維持酶活性的必要條件，然而反應(yīng)體系中水分含量超過一定限度，反應(yīng)會向水解方向進(jìn)行，使反應(yīng)混合物中游離脂肪酸含量增加，產(chǎn)品得率降低，但水分過低又會影響酶分子表面的水分子層，進(jìn)而影響酶分子的構(gòu)象和活性[14-15]。

圖4 加水量對辛酸插入率的影響Fig.4 Effect of water addition amount on the incorporation rate of caprylic acid

由圖4可以看出，在水添加量低于10%時，辛酸插入率是隨著水量的增加而增大的，可能是由于在水量添加較低時，酶的活性隨水量的增加而增大。然而當(dāng)水量繼續(xù)增加到15%時，辛酸插入率開始降低，過多的水反而使底物的水解、酰基轉(zhuǎn)移等副反應(yīng)發(fā)生[16-17]。

2.1.5 反應(yīng)時間對辛酸插入率的影響

從圖1～4可以看出，隨著反應(yīng)時間的延長，辛酸插入率逐漸升高，且在1～12h內(nèi)辛酸插入率增加迅速，而在12～24h辛酸插入率增加非常緩慢，說明在12h左右反應(yīng)已基本達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，因此再延長反應(yīng)時間沒有實際意義。綜上分析，選擇反應(yīng)時間為12 h。

2.2 響應(yīng)面試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

表2 酶法制備結(jié)構(gòu)脂質(zhì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface tests for optimizing the incorporation of caprylic acid

按表1試驗方案，采用多元回歸分析，擬合二次多項式回歸模型的Box-Behnken設(shè)計。所有實驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值，見表2。

2.2.2 回歸模型的建立及其顯著性檢驗

由Design－Expert 7.0 軟件，通過對多項式回歸分析，得到的擬合全變量二次回歸方程模型為：

由回歸方程可知，交互項的系數(shù)較小，說明響應(yīng)面分析所選的4個因素之間交互作用較小。由表3可知，在α＝0.01水平上，該模型失擬不顯著，回歸方程顯著。模型的決定系數(shù)R2為98.46549%，模型的擬合程度很好，能較好地反映各因素與響應(yīng)值變化的關(guān)系，可以用于結(jié)構(gòu)脂質(zhì)中辛酸插入率的理論預(yù)測。

表3 回歸模型的方差分析表(α＝0.01，置信度99%)Table 3 Analysis of variance for the fitted quadratic regression equation

2.2.3 響應(yīng)因素水平的優(yōu)化及模型驗證

對回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，尋找最優(yōu)組合條件，得到當(dāng)?shù)孜镂镔|(zhì)的量比(菜籽油:辛酸)1:3.57、加酶量10.57%(以底物質(zhì)量計)、加水量5.2%(以酶質(zhì)量計)、反應(yīng)溫度48.6℃、反應(yīng)12h后辛酸插入率的理論最高值可達(dá)到25.77%。

為了進(jìn)一步驗證上述模型與預(yù)定的可靠性，按上述組合條件進(jìn)行驗證實驗，重復(fù)3次，得到辛酸的平均插入率為23.19%，與預(yù)測值很接近，說明該模型擬合較好。

3 結(jié) 論

通過響應(yīng)面法優(yōu)化得出最優(yōu)條件為底物物質(zhì)的量比(菜籽油:辛酸)1:3.57、加酶量10.57%(以底物質(zhì)量計)、加水量5.2%(以酶質(zhì)量計)、反應(yīng)溫度48.6℃。在此條件下反應(yīng)12h，實測辛酸插入率為23.19%，與模型預(yù)測值25.77%非常接近。說明采用固定化脂肪酶TL IM催化菜籽油和辛酸合成結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的方法過程簡單，條件溫和，產(chǎn)物易于分離，有應(yīng)用生產(chǎn)的潛力。

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Lipase-Catalyzed Acidolysis of Rapeseed Oil for Preparing Structural Lipids

SHOU Jia-fei1，PAN Li-jun1,2,*，CAO Li-li1,2，LIU Mo1
(1. School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China；2. Key Laboratory for Agricultural Products Processing of Anhui Province, Hefei 230009, China)

In this study, the lipase (fromThermomyces lanuginosa)-catalyzed acidolysis process of rapeseed oil with caprylic acid was investigated to prepare structural lipids using single factor and response surface tests. The results showed that the incorporation rate of caprylic acid reached up to 23.19% at the conditions of the molar ratio between rapeseed oil and caprylic acid of 1:3.57, immobilized lipase addition amount of 10.57%, water addition amount of 5.2%, reaction temperature of 48.6 ℃and reaction time of 12 h. This investigation will be significance for improving the additional value of rapeseed oil and extending its industry chains.

rapeseed oil；caprylic acid；acidolysis；structural lipids；response surface methodology

TS229

A

1002-6630(2012)10-0029-04

2011-05-07

“十二五”國家科技支撐計劃項目(2011BAD02B04)

壽佳菲(1985— )，女，碩士研究生，研究方向為食品資源綜合利用。E-mail：shoujiafei@163.com

*通信作者：潘麗軍(1955—)，女，教授，碩士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品資源綜合利用。E-mail：panlijun1955@163.com