孫德一 張鐸 王海杰 李妍

1.延邊大學醫(yī)學部藥學院，延吉，133002

2.吉林醫(yī)藥學院免疫學與病原學教研室，吉林，132013

3.吉林醫(yī)藥學院藥學院，吉林，132013

流式細胞術分析五味子乙素促進阿霉素內化的實驗研究

孫德一1張鐸2王海杰3李妍2

1.延邊大學醫(yī)學部藥學院，延吉，133002

2.吉林醫(yī)藥學院免疫學與病原學教研室，吉林，132013

3.吉林醫(yī)藥學院藥學院，吉林，132013

[目的] 建立流式細胞術分析腫瘤細胞內阿霉素分布的方法，并研究低濃度五味子乙素對K562細胞內化阿霉素的影響。[方法] 體外培養(yǎng)豬內皮細胞(pEC），以20μmol/L阿霉素處理2、4和6小時；或加入不同濃度阿霉素（0、10、20、 40、80和100μmol/L）處理4小時。培養(yǎng)K562細胞，以5μmol/L阿霉素處理2、4和6小時；或加入不同濃度阿霉素（0、2.5、5、10和20μmol/L）處理4小時。采用不同濃度（0、25、50和100μmol/ L）五味子乙素（Sch B）與阿霉素聯(lián)合處理K562細胞4小時。收集細胞，采用流式細胞術分析阿霉素的特異熒光 。[結果] 固定濃度處理pEC（20μmol/L）和K562（5μmol/ L）后檢測，發(fā)現細胞內熒光強度隨時間延長而增加，兩種細胞4小時組熒光強度分別達到6小時組的96.93%和95.23%/。在直方圖上，陰性和陽性細胞群界限分明。阿霉素（2.5、5和10μmol/L）單獨處理細胞的熒光強度分別為26.78±3.34、64.70±6.24和118.35±9.67；添加25μmol/L Sch B實驗后熒光強度增加到43.45±4.25、103.74±7.36和146. 69±8.32，Sch B顯著增加了K562細胞內阿霉素的分布（p＜0.05）。[結論] 建立的方案可快速測定細胞內的阿霉素分布；低濃度Sch B促進腫瘤細胞內化阿霉素。

流式細胞術；阿霉素；五味子乙素

flow cytometry；adriamycin；schisandrin B

阿霉素（acriamycin）是臨床廣泛應用的抗癌藥，為血液系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌，肝癌和胃癌等高發(fā)腫瘤的一線化療藥。但與其他化療藥類似，原發(fā)和繼發(fā)耐藥問題嚴重。阿霉素的耐藥機制復雜，但最常見的為多藥耐藥基因產物P糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）等過度表達所導致[1]。五味子乙素（schisandrin B，Sch B）為五味子干果實中提取的木脂素類有效成分，可通過誘導細胞凋亡，阻滯細胞周期而抗腫瘤[2]。其體外抑制腫瘤的IC50為10～60μmol/L，但近年研究發(fā)現，低濃度的Sch B（≤30μmol/ L）可增強紅白血病、乳腺癌和肝癌等腫瘤對阿霉素、紫杉醇等P-gp底物類藥物的敏感性[3]。因此，測定Sch B對腫瘤細胞內化藥物的效率將有助研究其增敏機制，并為建立合理藥物聯(lián)合方案提供依據。

1.材料與方法

1.1 豬內皮細胞（p i g endotheliocyte, pEC ）和人紅白血病細胞K562由本室保存，小牛血清購自浙江黃巖四季青公司，F12和1640培養(yǎng)液購自Gibco公司，其他試劑為國產分析純。Sch B購自中國藥品生物制品檢定所，阿霉素為Farmitalia Carlo Eeba公司產品。流式細胞儀型號EPICS XL，由Beckman Coulter公司生產。

1.2 細胞培養(yǎng)與藥物處理

pEC細胞貼壁生長，采用含10%小牛血清F12培養(yǎng)液，在5%CO2、飽和濕度和37℃條件下培養(yǎng)。按1×105/ml接種細胞于培養(yǎng)瓶，恢復貼壁生長后，加阿霉素至20μmol/L，設不加阿霉素對照組，分別培養(yǎng)2，4和6小時后收集細胞；分別加阿霉素至0、10、20、40、80和100μmol/L，培養(yǎng)4小時收集細胞。K562為懸浮生長細胞，采用含10%小牛血清1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。接種K562細胞，加阿霉素至5μmol/L，同時設不加阿霉素的對照組，分別培養(yǎng)2，4和6小時后收集細胞。接種K562細胞，加入阿霉素至0、2.5、5、10、20和40μmol/ L，培養(yǎng)4小時收集細胞。為觀察五味子乙素對K562內化阿霉素的影響，按如下分組并處理4小時后收集：加阿霉素至終濃度為0、2.5、5和10μmol/L；相同的阿霉素濃度，分別加Sch B 至終濃度為25、50和100μmol/L。

1.3 流式細胞術分析

收集細胞后PBS洗2次后，立即用流式細胞儀第二熒光通道（FL2）檢測，收集數據后采用CXP軟件（Beckman coulter，USA）分析各組細胞的熒光強度。

1.4 統(tǒng)計學處理 以3次實驗的平均值±標準差來表示最終結果。單獨阿霉素處理組與阿霉素聯(lián)合Sch B組間相同濃度點的比較采用t檢驗。數據用SPSS15.0軟件做統(tǒng)計分析, 檢驗水準α＝0.05。

2.結果

2.1 流式細胞術分析阿霉素在細胞內分布

流式細胞術分析阿霉素特異熒光方案：在前向散射光（FS）為橫坐標、側向散射光(SS）為縱坐標的散點圖設門A，選擇分析細胞群（圖1-A）；在F2為橫坐標的單參數直方圖中，以不添加阿霉素對照組99%細胞為陰性設門B，B門內細胞占選定細胞A的99.0%以上；特異熒光陽性門為C（圖1-B），用平均（Mean，M）熒光強度來代表阿霉素在細胞內的分布。采用該方案分析20μmol/L 阿霉素處理K562細胞4小時的藥物分布：99%以上細胞在C門內，與對照組比較，平均熒光強度為209.55(210.12-0.57）（圖1-C）。

圖1 流式細胞術分析細胞內阿霉素特異熒光

阿霉素(20μmol/L）處理PEC細胞2、4和6小時，細胞內熒光強度隨時間延而增加（圖2-A）。2和4小時熒光平均值分別為6小時組82.80%和96.93%，即作用4小時細胞內化藥物已近該濃度下的極限。不同濃度藥物（10、20、40、80和100μmol/L）處理4小時后，細胞內的阿霉素平均特異熒光強度分別為41.79、71.35、103.03、123.49和129.52，即低濃度下（≤40μmol/L，細胞內阿酶素分布隨外液濃度增加而明顯增加；在40～100μmol/L間，阿酶素內化增幅平緩（圖2-B）。

圖2 處理時間和藥物濃度對批pEC細胞阿霉素分布的影響

不同時間和濃度的阿霉素處理K562細胞后流式細胞術分析，發(fā)現其趨勢與批pEC細胞相同：固定的藥物處理2和4小時，其熒光強度分別為6小時組的72.89%和95.39%（圖3-A）。0、2.5、5、10和20μmol/L處理4小時，細胞內阿酶素分布隨細胞外液濃度增加而明顯增加；而濃度在20～40μmol/L間，阿霉素內化的增幅平緩（圖3-B）

圖3 不同濃度阿霉素對K562細胞阿酶素熒光的影響

2.2 五味子乙素促進K562細胞內化阿霉素

2.5、5 和10 μmol/L阿霉素單獨處理4小時，K562細胞內阿霉素的熒光強度分別為26.78±3.34、64.70±6.24和118.35±9.67；添加25μmol/L Sch B的實驗組，熒光強度分別增到43.45±4.25、103.74±7.36和146.69±8.32，Sch B顯著增加了K562細胞內阿霉素的分布（p＜0.05）。50和100μmol/L Sch B組的阿霉素的熒光強度高于阿霉素單獨作用組和25μmol/L Sch B，但50和100μmol/L Sch B組間無顯著差異（圖4）。以上結果表明，低濃度的Sch B即可促進阿霉素的內化。

3.討論

阿霉素為分子量 543.52的大環(huán)內酯類藥物，是P-gp的靶分子。當腫瘤原發(fā)為P-gp高表達，或化療藥物誘導其表達增加后，可加速阿霉素等大環(huán)內酯類藥物被“藥泵”運出細胞的效率，從而產生耐藥[4]。因此，檢測細胞內藥物濃度對研究其耐藥機制、篩選增敏藥物和預測療效有重要意義。利用阿霉素發(fā)射的紅色熒光，我們分析了濃度和處理時間對細胞內藥物分布的影響。藥物處理4小時熒光強度隨藥物濃度增加而增強；同時發(fā)現熒光在直方圖中峰值集中，陰性和陽性細胞群界限分明。因此，所建立的方案操作簡單、標本量小，用來分析藥物濃度具有獨特優(yōu)勢。

研究報道，低濃度的Sch B可增強紅白血病、乳腺癌和肝癌等腫瘤對阿霉素、紫杉醇等P-gp底物類藥物的敏感性。本研究測定了不同濃度Sch B對K562細胞內化阿霉素的影響。發(fā)現，低濃度的Sch B即可顯著增強阿霉素在細胞內的分布?；熕幬锞卸靖弊饔茫档退幬镉昧靠蓽p輕毒副作用[5]。將Sch B與阿霉素聯(lián)合應用，可通過促進藥物內化而形成協(xié)同作用。本研究所建立的阿霉素檢測方法，以及低濃度的Sch B促進藥物內化的證據，為篩選阿霉素的增敏藥物，建立合理的藥物聯(lián)合方案提供依據。

圖4 不同濃度阿霉素對K562細胞內化阿霉素的影響

[1]梁軍，宋曉玉，劉志新，李月珍. 五味子乙素對人胃癌細胞株MGC-803凋亡的影響.中國老年病學雜志，2011，31(1）：88～90.

[2]苗迎秋,李志,高文倉. 阿霉素誘導的卵巢癌耐藥細胞P- 糖蛋白的表達. 大連醫(yī)科大學學報,2010,32(1）:35～40.

[3]李凌, 王弢,許志良,俞穎,陳衛(wèi),陳菲. 五味子乙素對轉染多藥耐藥1基因的MCF-7細胞的多藥耐藥逆轉作用. 中華醫(yī)學雜志，2005，85(23）：1633～1637.

[4]孫華, 劉耕陶.五味子果仁醇提取物含藥血清逆轉腫瘤多藥耐藥及抑制耐藥糖蛋白( P-gp）的作用.中國新藥雜志，2009，18（12）：1130～1135.

[5]傅軍，俞杰，徐宏彬，李玲. 中醫(yī)藥輔助實體腫瘤化療增效減毒的系統(tǒng)性評價.中醫(yī)藥導報，2010，16（10）：108～112.

Analyzing the promotion of internalization of adriamycin by schisandrin B through flow cytometry

Sun Deyi 1, Zhang Duo 2, Wang Haijie 3, Li Yan 2
1. The Department of Pharmacy in The Medical College of Yanbian Univercity,Yanji, 1330022. The Department of Immunology and Etiology of Jilin Medical College,Jilin, 132013
3. The Department of Pharmacy of Jilin Medical College,Jilin, 132013

Objective: To establish a method to analyze content of adriamycin in tumor cells by flow cytometry (FCM）and to analyze the effect of internalization of adriamycin into tumor cells promoted by schisandrin B. Method: Pig endothelia cells (pEC）were cultured with or without 20μmol/L adriamycin for indicated time ( 2, 4and 6hours）, or in the presence of different concentration (0,10,20,40and 80μmol/L ）of adriamycin for 4hours. Human erythroleukemia cells K562were cultured with or without 5μmol/L adriamycin for indicated time (2, 4and 6hours）, or in the presence of different concentration (0, 2.5, 5, 10and 20μmol/ L ）of adriamycin for 4hours. K562cells were treated by different concentration of adriamycin in the presence of schisandrin B (0，25，50and 1005μmol/L）. The specific red fluorescence of adriamycin in those cells were detected by FCM. Result: The fluorescence in pEC and K562cells treated by determined concentration of adriamycin (10μmol/L or 5μmol/L）increased timedependently. Compared with cells treated for 6hours, cells treated for 4hours presented almost 96.93% and 95.23of fluorescence. Fluorescence positive and negative cells were distinct well in the histograms. The fluorescence in K562cells treated by adriamycin ( 2, 5and105μmol/ L）along were 26.78±3.34、64.70±6.24and 118.35±9.67.The addition of 25μmol/ L Sch B promoted the internalization of adriamycin to 43.45±4.25、103.74±7.3and 146.69±8.32( p＜0.05）. Conclusion: The method to analyze content of adriamycin in tumor cells by FCM was established .It was confirmed that lower concentration of Sch B could promoted the internalization of adriamycin .

10.3969/j.issn.1001-8972.2012.07.092

吉林省教育廳十二五科研基金（編號2011420）

，李妍（1972-），女，博士，副教授，從事細胞與分子免疫學研究工作。