韓玉珠，石磊嶺，金 莎，張 晶,*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.新疆中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

反相高效液相色譜法測(cè)定辣椒中4種辣椒堿類成分的含量

韓玉珠1，石磊嶺2，金 莎3，張 晶3,*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.新疆中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

目的：建立同時(shí)測(cè)定辣椒中辣椒素、二氫辣椒素、降二氫辣椒素和高辣椒素 4 種辣椒堿類成分的反相高效液相色譜方法，并對(duì)30個(gè)辣椒品種中辣椒堿含量進(jìn)行比較。方法：采用Nucleosil C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相乙腈-水，梯度洗脫；柱溫45℃；流速1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)280nm。結(jié)果：辣椒素、二氫辣椒素、降二氫辣椒素和高辣椒素的線性關(guān)系良好，范圍均為1.0～160.0μg/mL，相關(guān)系數(shù)在0.9965～0.9993之間，精密度、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于2.7%，加標(biāo)回收率介于97%～99%。辣椒堿在不同辣椒品種中含量差異顯著。結(jié)論：對(duì)30個(gè)樣品測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。當(dāng)辣椒素和二氫辣椒素含量大于0.1%時(shí)，辣椒有明顯的辣感。

辣椒；反相高效液相色譜；辣椒素；二氫辣椒素；降二氫辣椒素；高辣椒素

辣椒，為茄科(Solanaceae)辣椒屬(Capsicum)植物，在世界范圍廣泛栽培，屬藥食同源植物，為重要的蔬菜和調(diào)味品，干燥成熟果實(shí)更可入藥，歸心、脾經(jīng)。具有溫中散寒，開胃消食之功效，用于寒滯腹痛，嘔吐、瀉痢、凍瘡等癥[1]。我國(guó)是辣椒生產(chǎn)大國(guó)，又是辣椒食用大國(guó)，有5個(gè)栽培種[2]，其中辣椒(Capsicum annuum L.)在我國(guó)廣為栽培，已經(jīng)培育了眾多的品種。本實(shí)驗(yàn)以其中07-4川椒等30個(gè)品種作為研究對(duì)象。

辣椒堿是辣椒產(chǎn)生辛辣味道的主要成分，是一系列同源支鏈堿基香草胺的混合物，包括辣椒素、二氫辣椒素、降二氫辣椒素、高辣椒素等。辣椒堿亦是辣椒中主要活性成分，具有鎮(zhèn)痛[3]、抗癌[4]、調(diào)節(jié)心血管壓力[5]、保護(hù)胃黏膜[6]、減肥[7]、刺激毛發(fā)生長(zhǎng)[8]等功能。辣椒堿含量不僅反映了辣椒及其制品的風(fēng)味，而且可以作為衡量其質(zhì)量的指標(biāo)，是選擇富含活性物質(zhì)的辣椒品種，提高辣椒附加值的依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)以自制辣椒素、二氫辣椒素、降二氫辣椒素和高辣椒素為對(duì)照品，采用超聲輔助溶劑提取法對(duì)樣品進(jìn)行處理，建立反相高效液相色譜(resersed-phase high performance liquid chromatography，HPLC)法同時(shí)檢測(cè)4種辣椒堿含量的條件，并對(duì)該法進(jìn)行方法學(xué)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)并比較了30個(gè)辣椒品種中4種辣椒堿的含量，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確。結(jié)果顯示，辣椒品種不同，其中的各辣椒堿含量差異較大。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用辣椒樣品均采自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院實(shí)驗(yàn)田，為茄科(Solanaceae)辣椒屬辣椒(Capsicum annuum L.)的30個(gè)栽培品種。

辣椒素(CA)、降二氫辣椒素(NDC)、二氫辣椒素(DC)、高辣椒素(HC)對(duì)照品(采用UV、MS、NMR等波譜學(xué)方法確定其結(jié)構(gòu)，經(jīng)HPLC法測(cè)定其純度不低于98%(歸一化法)) 自制；乙腈(色譜純) 美國(guó)Fisher公司；丙酮(分析純) 北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-2010液相色譜儀(SPD-20Avp紫外檢測(cè)器、柱溫箱、化學(xué)工作站) 日本島津公司；Nucleosil C18ODS 色譜柱(4.6mm×250mm，5μm) 美國(guó)Agilent 公司；UV2450紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取CA、NDC、DC和HC各5mg，分別置于5mL容量瓶中，乙腈定容，制成1mg/mL對(duì)照品溶液。

1.3.2 樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取各樣品粉末2.0g于50mL錐形瓶中，以丙酮室溫條件下超聲提取3次(丙酮用量分別為30、20、20mL)，每次20min，合并提取液，濃縮至干，用乙腈分別定容于10mL容量瓶，制成樣品溶液。測(cè)定前用0.45μm微孔濾膜過濾。

1.3.3 色譜條件

Nucleosil C18ODS色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；柱溫：45℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm；進(jìn)樣量：20μL；流動(dòng)相：乙腈(A)、蒸餾水(B)；梯度等速洗脫；流速：1.0mL/min；梯度洗脫程序?yàn)椋?～30min，40%～44% A；30.1min，40% A。

1.3.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取對(duì)照品溶液1、10、20、40、80、160μL混合，用乙腈定容于1mL容量瓶，制成系列混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

分別吸取6個(gè)不同質(zhì)量濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液20μL進(jìn)樣，測(cè)定4種辣椒堿峰面積，以各辣椒堿濃度為橫坐標(biāo)(x)、積分面積值為縱坐標(biāo)(y)，進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液中4種不同辣椒堿的回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液及尖辣椒樣品的HPLC分析

圖1 4種辣椒堿混合標(biāo)準(zhǔn)品(a)及尖辣椒(b)樣品的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standard capsaicinoids (a) and chili pepper extract

由圖1可知，4種辣椒堿色譜峰的保留時(shí)間分別為14.81、16.53、24.02、25.69min。由于樣品過多，圖1中選取了有代表性的尖辣椒樣品譜圖。

2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液中辣椒堿回歸方程

4種辣椒堿的線性回歸方程為：yNDC＝538424x＋106，R2＝0.9931；yCA＝546287x＋106，R2＝0.998；yDC＝6378591x－41973，R2＝0.9987；yHC＝742039x－346632，R2＝0.9974。線性關(guān)系良好，線性范圍均為1.0～160.0μg/mL。

2.3 辣椒堿穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按1.3.3 節(jié)條件，取辣椒素混合標(biāo)準(zhǔn)品，分別于0、2、4、8、12、24h進(jìn)行各辣椒堿含量的測(cè)定。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)品溶液于24h內(nèi)，色譜峰面積無明顯變化，NDC、CA、DC和HC的色譜峰面積RSD值分別為2.39%、1.98%、2.23%、2.62%。

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一辣椒樣品溶液，在1.3.3節(jié)條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，NDC、CA、DC和HC色譜峰面積的RSD分別為：1.55%、1.28%、1.53%、1.38%(n＝6)。表明本方法重復(fù)性較好。

2.5 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

精密量取對(duì)照液于5份已知各辣椒堿含量的辣椒樣品粉末中，按1.3.2節(jié)進(jìn)行處理，在1.3.3節(jié)條件下進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見表1。

表1 4種辣椒堿的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Table 1 Average spike recovery rates of 4 capsaicinoids in a known sample (n＝6)

結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)提取及處理方法對(duì)于各單體辣椒素回收率介于97%～99%，符合測(cè)定要求。

2.6 辣椒樣品中4種辣椒堿含量的測(cè)定

表2 辣椒樣品中的4種辣椒堿含量Table 2 Contents of 4 capsaicinoids in 30 chili pepper varieties

續(xù)表2

對(duì)30個(gè)辣椒品種中的4種辣椒堿(NDC、CA、DC和HC)含量進(jìn)行測(cè)定，由表2可知，各成分含量在不同的辣椒樣品中差異顯著。其中，辣椒素在07-9中含量最高為0.22%，紅羅丹甜椒中含量最低為0.001%，相差220倍；DC在甜椒長(zhǎng)方中含量最高為0.11%，蕭新九號(hào)中含量最低為0.0021%，相差50倍；NDC在07-9中含量最高為0.018%，帝王中含量最低為0.0042%，相差4.5倍；HC在07-9中含量最高為0.0088%，A185F2中含量最低為0.0001%，相差88倍。4種成分中，以NDC在辣椒樣品中含量差距最小。

3 討論與結(jié)論

由于辣椒堿類物質(zhì)對(duì)熱不穩(wěn)定，因此本實(shí)驗(yàn)參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 10783—2008《食品添加劑辣椒紅》中辣椒素提取方式，采用超聲輔助法，在室溫下對(duì)樣品中辣椒堿進(jìn)行提取，避免高溫對(duì)待測(cè)成分的影響[9]。按此提取方法制備的樣品溶液在測(cè)定指標(biāo)區(qū)域內(nèi)峰型簡(jiǎn)單，無其他成分峰干擾。

對(duì)于辣椒中辣椒堿類成分含量的檢測(cè)方法，以單一辣椒素或同時(shí)測(cè)定辣椒素和DC含量報(bào)道居多[10-11]。其主要原因在于NDC、HC等標(biāo)準(zhǔn)品難以獲得，本實(shí)驗(yàn)以自制的4種辣椒堿為標(biāo)準(zhǔn)品，在前期工作基礎(chǔ)上[12]，建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定辣椒中的4種辣椒堿類物質(zhì)的條件，且分離度高、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，不僅可為較全面地控制和評(píng)價(jià)辣椒及其制品的品質(zhì)提供方法，同時(shí)也為辣椒堿在食品添加劑監(jiān)測(cè)和控制等方面提供量化參考。

采用本實(shí)驗(yàn)建立的方法對(duì)不同的辣椒栽培品種進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，不同品種辣椒果實(shí)中4種辣椒堿類成分含量有較大差異，且與已有報(bào)道“辣椒素約占辣椒堿的46%～77%”[13]的結(jié)果存在出入，如在甜椒長(zhǎng)方品種中，CA含量只占辣椒堿的13.57%，而DC的含量卻很高，成為此品種辣椒產(chǎn)生辣味的主要成分；但與CA和DC之和約占辣椒堿的90%[14]的報(bào)道結(jié)論相吻合。結(jié)合各辣椒果實(shí)的外觀及辣度口感發(fā)現(xiàn)，外觀為牛角或者羊角形，且口感較辣的辣椒品種，其CA和DC含量之和基本大于等于0.1%，如A185、07-9、尖辣椒、甜椒長(zhǎng)方、巴萊姆、金武士彩椒等品種果實(shí)辣度強(qiáng)于其他品種。

辣椒的應(yīng)用范圍極廣，對(duì)于辣椒品種的篩選必然要以其內(nèi)在質(zhì)量為依據(jù)。根據(jù)不同的需求選擇適當(dāng)?shù)钠贩N，可充分提高辣椒的利用價(jià)值。

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RP-HPLC Determination of 4 Capsaicinoids in Chili Peppers

HAN Yu-zhu1，SHI Lei-ling2，JIN Sha3，ZHANG Jing3,*
(1. College of Horticulture, Jilin Agricultural University, Chang..ch..un 130118, China；
2. Xinjiang Institute of Chinese Materia Medica and Ethnodrug, Urumqi 830002, China；
3. College of Chinese Medicine Material, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Objective: A reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) method was established to simultaneously determine 4 capsaicinoids including capsaicin, dihydrocapsaicin, nordihydrocapsaicin and homocapsaicin in chili peppers. Methods: Capsaicinoids were separated on a Nucleosil C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) using a mobile phase composed of acetonitrile and water through gradient elution at a flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 280 nm. Results: An excellent linear relationship between peak areas and concentrations of 4 capsaicinoids in the range of 1.0 －160.0 μg/mL with correlation coefficients of 0.9965－0.9993 was observed. The precision and stability RSD (%) of this method were lower than 2.7%. The average recovery rates of 4 capsaicinoids was 97% －99% (n＝6). The contents of 4 capsaicinoids in 30 chili pepper varieties revealed an obvious difference. Conclusion: This method has been successfully used to determine 30 chili pepper varieties with stable and reproducible results. Moreover, piquancy taste is obvious when the total content of capsaicin and dihydrocapsaicin is more than 0.1%.

chili peppers；reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC)；capsaicin；dihydrocapsaicin；nordihydrocapsaicin；homocapsaicin

TS255.7；TS202.1

A

1002-6630(2012)16-0257-04

2011-08-07

吉林省財(cái)政廳科研育種專項(xiàng)

韓玉珠(1971—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭卟擞N與安全生產(chǎn)。E-mail：hanyzh2003@126.com

*通信作者：張晶(1971—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：zhjing0701@163.com