林春榕，潘 云，吳學(xué)東，曲文超，路會(huì)俠，莊立峰，劉慶文，盛 盼

（1.大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.大理學(xué)院附屬醫(yī)院，云南大理 671000）

幼鼠小腸缺血-再灌注腸組織的形態(tài)學(xué)觀察

林春榕1，潘 云2，吳學(xué)東2，曲文超2，路會(huì)俠2，莊立峰2，劉慶文2，盛 盼2

（1.大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.大理學(xué)院附屬醫(yī)院，云南大理 671000）

目的：觀察幼鼠小腸缺血-再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）腸組織形態(tài)學(xué)變化。方法：將32只4周齡（Sprague Dawley，SD）大鼠隨機(jī)分成2組即假手術(shù)組（Sham組）和缺血-再灌注組（I/R組），每組各16只。Sham組僅暴露腹腔臟器，不作任何干預(yù)；I/R組經(jīng)阻斷腸系膜上動(dòng)脈60 min后恢復(fù)血供，于再灌注30、60、90、120 min每組動(dòng)物各處死4只取小腸組織進(jìn)行組織學(xué)Chiu’s評(píng)分，結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析和組間t檢驗(yàn)。結(jié)果：Sham組腸組織形態(tài)正常；I/R組小腸組織發(fā)生了明顯的缺血和炎癥反應(yīng)并隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)而加重，各觀察時(shí)間點(diǎn)組織學(xué)評(píng)分在組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各值在I/R組高于Sham組（P＜0.05）。結(jié)論：幼鼠腸I/R導(dǎo)致腸組織病理?yè)p傷并隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)而加重。

腸缺血-再灌注損傷；腸組織；組織學(xué)；幼鼠

腸缺血-再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）是小兒常見的問題〔1-3〕，盡管由于各種原因?qū)е履cI/R所導(dǎo)致的腸道損傷已被廣泛重視，但通常情況下難以獲得腸I/R后的組織標(biāo)本進(jìn)行研究，因而對(duì)小兒腸I/ R腸組織損傷的變化規(guī)律和轉(zhuǎn)歸認(rèn)識(shí)尚少，本研究利用幼鼠造成腸I/R模型并動(dòng)態(tài)觀察腸管I/R的后腸組織的形態(tài)學(xué)變化，以此闡述腸I/R對(duì)腸組織形態(tài)的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡健康（Sprague Dawley，SD）大鼠幼鼠共32只，雌雄不限，SPF級(jí)，動(dòng)物編號(hào)：許可證SCXK（渝）2007-017，體重100±15 g。手術(shù)室溫度25～27℃，相對(duì)濕度50%～65%。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑、器械、儀器 10%水合氯醛溶液（大理學(xué)院附屬醫(yī)院制劑室配制）；0.9%生理鹽水；常用消毒劑；小手術(shù)器械及手術(shù)用品。

BM-Ⅷ生物組織包埋及冷凍機(jī)（孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司），PHY-Ⅲ病理組織漂烘儀（常州市中威電子儀器有限公司），萊卡石蠟切片機(jī)（LE-ICARM2025型），OLYMPUSBX-41型多功能生物顯微鏡（日本奧林巴斯光學(xué)有限公司）和HMIAS-2000型高清晰醫(yī)學(xué)彩色圖象分析儀（武漢千屏影像公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 32只DS大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）和I/R組，每組16只。

1.2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 用10%水合氯醛溶液腹腔內(nèi)注射（3 mL/kg）麻醉后仰臥位固定，腹部去毛，消毒后取上腹正中縱行切口，依次切開入腹，尋找并游離腸系膜上動(dòng)脈（superior mesenteric artery，SMA）根部，見圖1。用橡皮條阻斷腸系膜上動(dòng)脈血流60 min，見圖2。松開橡皮條，恢復(fù)腸系膜血流，造成小腸缺血-再灌注模型。Sham組動(dòng)物在開腹后不做任何干預(yù)于I/R組再灌注后30、60、90、120 min時(shí)4個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組各處死動(dòng)物4只，取距回盲瓣5 cm處近端2 cm長(zhǎng)的小腸標(biāo)本備做組織學(xué)研究。

圖1 尋及腸系膜上動(dòng)脈

圖2 阻斷腸系膜上動(dòng)脈血供

1.2.3 組織學(xué)觀察 所取小腸組織制成6～8 μm厚度的切片后進(jìn)行H-E染色，光鏡下觀察腸粘膜的形態(tài)學(xué)變化，每張切片隨機(jī)選擇鏡下10視野（100×），腸粘膜損傷程度按Chiu氏6級(jí)評(píng)分法〔4-5〕進(jìn)行組織病理評(píng)分：0級(jí)為正常腸粘膜絨毛結(jié)構(gòu)，組織形態(tài)正常，記為0分；1級(jí)為腸粘膜絨毛頂端上皮下間隙增寬，腸壁組織水腫，記為1分；2級(jí)為絨毛上皮下間隙明顯增寬，絨毛上皮與固有膜剝脫，記為2分；3級(jí)為絨毛上皮成塊脫落，記為3分；4級(jí)為絨毛上皮完全脫落，固有膜結(jié)構(gòu)裸露，記為4分；5級(jí)為固有膜結(jié)構(gòu)崩解形成潰瘍并出血，記為5分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS11.0整理數(shù)據(jù)。各組資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間進(jìn)行單因素方差分析和組間t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)共用動(dòng)物32只，I/R組經(jīng)夾閉腸系膜上動(dòng)脈后相應(yīng)腸系膜血管搏動(dòng)消失，腸管顏色蒼白并逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榘底仙?，見圖3。缺血60 min后恢復(fù)血供，在再灌注后30 min腸管顏色逐漸恢復(fù)的同時(shí)逐漸出現(xiàn)腸壁充血水腫并不斷加重，至再灌注90 min時(shí)腸管呈現(xiàn)暗紫色形如缺血60 min時(shí)的改變，見圖4。繼之腸管顏色逐漸好轉(zhuǎn)，直至120 min時(shí)腸管色澤恢復(fù)但水腫仍然較為明顯。

圖3 小腸缺血再灌注模型

圖4 小腸缺血后再灌注90 min的腸管改變

2.1 組織學(xué)觀察結(jié)果 Sham組腸組織無(wú)水腫及出血，腸管各層及腸組織內(nèi)各結(jié)構(gòu)正常。見圖5。

I/R組在再灌注30 min的腸組織可見充血水腫，而在60 min及以后2個(gè)時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)小腸絨毛脫落和缺損、點(diǎn)狀出血和潰瘍形成、粘膜不同程度的絨毛排列紊亂和組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，其中再灌注以90 min時(shí)最為明顯，呈現(xiàn)明顯的粘膜上皮脫落，潰瘍形成并出血，腸組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和組織結(jié)構(gòu)松散。見圖6。120 min時(shí)腸組織形態(tài)無(wú)明顯改善，但潰瘍和出血情況也無(wú)明顯加重。

圖5 正常腸粘膜（HE×100）Chiu氏評(píng)分0分

圖6 缺血再灌注組腸粘膜（HE×100）Chiu氏評(píng)分5分

2.2 腸粘膜損傷程度的Chiu氏6級(jí)評(píng)分 通過對(duì)小腸組織進(jìn)行病理?yè)p傷的Chiu氏6級(jí)評(píng)分，獲得各組各時(shí)間點(diǎn)的平均分值。見表1。Sham組各時(shí)間點(diǎn)的評(píng)分值變化較小，而各時(shí)間點(diǎn)I/R組的評(píng)分值均較Sham組增高，并呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢(shì)，其中以再灌注90 min時(shí)為最高，120 min時(shí)有所回降。

表1 各組各時(shí)間點(diǎn)小腸粘膜損傷病理Chiu氏評(píng)分結(jié)果

Chiu’s評(píng)分值在組間比較經(jīng)單因素方差分析和組間各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)評(píng)分值比較經(jīng)t檢驗(yàn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，I/R組的評(píng)分明顯高于Sham組（P＜0.05）；在組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)Chiu’s評(píng)分值比較，Sham組各時(shí)間點(diǎn)測(cè)得值間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而在I/R組內(nèi)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但僅在60、90和120 min時(shí)的評(píng)分高于30 min時(shí)的評(píng)分值，而評(píng)分值在60、90、120 min 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

腸I/R是常見的臨床問題，也是小兒外科常見的臨床現(xiàn)象。腸扭轉(zhuǎn)、嵌頓疝、腸套疊、粘連帶壓迫、腸內(nèi)糞石或蛔蟲團(tuán)塊等多種原因所致腸梗阻和小腸移植、失血性休克等均造成腸缺血，在腸梗阻整復(fù)和、休克復(fù)蘇后使腸管血供恢復(fù)即形成腸I/R。腸缺血將造成不同程度的組織損傷，而再灌注后腸組織在原缺血造成損傷的基礎(chǔ)上組織損傷將進(jìn)一步加重，則形成再灌注損傷。腸道的血供豐富因而對(duì)缺血缺氧十分敏感，是再灌注損傷時(shí)最易受累的器官之一，然而腸道又是大量細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物內(nèi)毒素的貯存場(chǎng)所，腸I/R不僅可導(dǎo)致腸道損傷還可導(dǎo)致遠(yuǎn)隔器官的損傷，甚至發(fā)生多系統(tǒng)和器官功能衰竭〔6-7〕。因此，進(jìn)行腸I/R腸組織形態(tài)學(xué)研究對(duì)進(jìn)一步研究和認(rèn)識(shí)小兒腸I/R損傷及其發(fā)生機(jī)制有重要的意義。

本實(shí)驗(yàn)利用幼鼠制作腸I/R模型，在結(jié)扎腸系膜上動(dòng)脈阻斷小腸血供1 h后恢復(fù)血流灌注，腸管色澤好轉(zhuǎn)，但再灌注90 min時(shí)腸管再度呈現(xiàn)缺血的改變；在再灌注的120 min觀察期內(nèi)，腸管水腫進(jìn)行性加重，而Sham組腸管外觀無(wú)明顯變化。組織學(xué)上呈現(xiàn)缺血和炎癥的改變并隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)而加重，其中以再灌注90 min時(shí)改變最為明顯，對(duì)組織學(xué)損傷程度的Chiu氏評(píng)分結(jié)果與腸管大體和鏡下改變相吻合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，幼鼠小腸缺血1 h恢復(fù)血供后，腸組織缺血的狀況并不隨著血供恢復(fù)而迅速改善，而是呈現(xiàn)缺血的后果—壞死逐漸變得明顯，隨著再灌注時(shí)間延長(zhǎng)出現(xiàn)粘膜點(diǎn)狀出血和潰瘍形成；在再灌注過程中，腸組織發(fā)生了炎癥反應(yīng)，出現(xiàn)組織充血、水腫、滲出、壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的病理過程。如果說缺血的改變?cè)从谀c系膜血供的中斷，并在再灌注過程中逐漸表現(xiàn)出來(lái)，而組織壞死脫落需要時(shí)間，因而表現(xiàn)為再灌注過程中缺血的改變逐漸加重，那么炎癥反應(yīng)則是在缺血基礎(chǔ)上組織發(fā)動(dòng)的另一病理過程，這一過程造成了新的更嚴(yán)重的變化，表現(xiàn)為腸管缺血—好轉(zhuǎn)—再缺血—最終好轉(zhuǎn)。出現(xiàn)再缺血的現(xiàn)象可能歸結(jié)于“無(wú)復(fù)流現(xiàn)象（no-reflow phenomenon）”〔7〕。

本實(shí)驗(yàn)觀察再灌注時(shí)間雖較短，但卻發(fā)生了腸組織形態(tài)的轉(zhuǎn)折性變化，這可能與動(dòng)物年齡和處理因素有關(guān)。由于幼年動(dòng)物機(jī)體的防御機(jī)制發(fā)育并不完善，且組織中水的含量大于成年動(dòng)物，加之幼年動(dòng)物的修復(fù)能力較強(qiáng)，一旦有損傷因素存在組織將發(fā)生快速而明顯的反應(yīng)，而一旦損傷因素去除，修復(fù)也比較快。有對(duì)肝臟I/R損傷的研究表明，幼年動(dòng)物的病理改變較成年動(dòng)物的改變輕〔8〕。本實(shí)驗(yàn)僅阻斷幼鼠小腸動(dòng)脈血供，而在臨床各種原因?qū)е滦耗cI/R損傷往往都是先發(fā)生靜脈回流障礙，繼之動(dòng)脈血供中斷，患兒腸管的病理變化應(yīng)該更為明顯而且病理過程更長(zhǎng)。有學(xué)者通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察到，在相同的觀察時(shí)間內(nèi)，不同的處理因素獲得的病理改變程度也不一致，其中阻斷動(dòng)脈血供的病理改變較阻斷靜脈或動(dòng)靜脈同時(shí)阻斷的變化要輕〔9〕。基于以上原因，在本實(shí)驗(yàn)觀察到再灌注過程中幼鼠腸管出現(xiàn)一過性再缺血的現(xiàn)象。

研究表明，幼鼠腸I/R導(dǎo)致腸組織缺血性損傷的同時(shí)發(fā)生了炎癥反應(yīng)并隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)而加重，但其機(jī)制尚未完全明了，有待進(jìn)一步研究。

〔1〕沈淳，鄭珊.小腸缺血再灌注損傷在腸套疊患兒的臨床觀察〔J〕.中華小兒外科雜志，2005，26（10）：540-543.

〔2〕王素寧.小兒腸梗阻時(shí)腸缺血的外科分析〔J〕.臨床小兒外科雜志.2003，2（2）：141-142.

〔3〕劉慶文，林春榕，吳學(xué)東.可轉(zhuǎn)錄因子NF-κB與腎臟缺血-再灌注損傷〔J〕.中外醫(yī)療，2011，30（9）：185-186.

〔4〕Chiu CJ，McArdle AH，Brown R，et al.Intestinal mucosal lesion in low-flow states〔J〕.Arch Surg，1970，101（4）：478-483.

〔5〕Gavrinaia G，Oliveira-Filhoa RM，Trezena AG，et al. Lung microvascular permeability and neutrophil recruitment are differently regulated by nitic oxide in a rat model of intestinal ischemia-reperfusion〔J〕.Eur J Pharm，2004，494（3）：241-249.

〔6〕Deitch EA.Role of the gut in multiple system organ failure〔J〕.Curr Opin Crit Care，2001，7（2）：92-98.

〔7〕曲文超，林春榕，吳學(xué)東.缺血再灌注肺損傷機(jī)制的研究進(jìn)展〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述，2011，17（4）：487-489.

〔8〕Park Y，Hirose R，Coatney JL，et al.Ischemia-reperfusion injury is more severe in older versus young rat livers〔J〕.J Surg Res，2007，137（1）：96-102.

〔9〕Guzmán-de la Garza FJ，Cámara-Lemarroy CR，Alarcón-Galván G，et al.Different patterns of intestinal response to injury after arterial，venous or arteriovenous occlusion in rats〔J〕.World J Gastroenterol.2009，15（31）：3901-3907.

Histological Study of Intestine with Ischemia/Reperfusion Injury in Young Rats

LIN Chunrong1,PAN Yun2,WU Xuedong2,QU Wenchao2,LU Huixia2,ZHUANG Lifeng2,LIU Qingwen2，SHENG Pan2
（1.Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China；2.Affiliated Hospital of Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To explore the intestinal histological changes of intestinal ischemic/reperfusion（I/R）injury in young rats. Methods:32 Sprague Dawley（SD）rats at 4 weeks old were divided into 2 groups with 16 in each group randomly,and there were sham operated group as a control and I/R group.The abdominal cavity were exposed in all rats but not any intervene in sham group, the superior mesenteric artery were occluded in I/R group for 60 min and followed by 30 min,60 min,90 min and 120 min for reperfusion and 4 rats were harvested at each time point.The intestine specimens were obtained for pathological study and determination of histopathologic score.The data were analyzed statistically.Results:There were pathological changes of ischemia and inflammatory obviously and getting severer with the reperfusion time prolong in all rats but in the sham group.There was statistical significance as a result of the Chiu's score between two groups in every time point（P＜0.05）.The scores in I/R group were higher than that in sham group（P＜0.05）.The score was highest at 90min among four time points in each I/R group.Conclusion:The pathological changes of intestinal injury caused by I/R were getting severer with reperfusion prolong.

intestinal ischemia-reperfusion injury；intestine；histology；young rat

Q463［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A［文章編號(hào)］1672-2345（2012）03-0024-04

云南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2009ZC121M）

2011-12-31

2012-03-06

林春榕，副教授，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究.

（責(zé)任編輯 董 杰）