胡洪森，葉 斌

（武漢生物工程學(xué)院生物技術(shù)系，湖北 武漢 430415）

溴乙錠對(duì)出芽短梗霉的誘變作用

胡洪森，葉 斌

（武漢生物工程學(xué)院生物技術(shù)系，湖北 武漢 430415）

采用溴乙錠對(duì)出芽短梗霉進(jìn)行誘變，得到一株不產(chǎn)色素的變異菌種BM2－5，液體發(fā)酵細(xì)胞全部呈酵母態(tài)，在以大米酶解葡萄糖為碳源的液體培養(yǎng)基中于27℃、200 r·min－1搖瓶培養(yǎng)72 h得到白色的普魯蘭粗多糖，最高產(chǎn)量達(dá)68.06 g·L－1。

出芽短梗霉；誘變；溴乙錠；普魯蘭

普魯蘭（Pullulan）是由α－1，4糖苷鍵形成的麥芽三糖和極少量麥芽四糖以α－1，6糖苷鍵連接而成的直鏈多糖，在出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）的培養(yǎng)物中被發(fā)現(xiàn)并分離提純出來［1］。普魯蘭為白色非結(jié)晶粉末，易溶于水，安全無毒，低熱值，具有可塑性好、成膜性好、膜隔氣性好等特性，在醫(yī)藥、食品、化妝品、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景［1，2］。對(duì)普魯蘭進(jìn)行化學(xué)修飾，根據(jù)不同需要制備普魯蘭衍生物，可進(jìn)一步拓展普魯蘭的應(yīng)用范圍［3］。

出芽短梗霉在產(chǎn)生普魯蘭多糖的同時(shí)也產(chǎn)生色素，使多糖提純困難。目前，已有分離［4］、誘變［5，6］低產(chǎn)色素或不產(chǎn)色素菌株以及菌株發(fā)酵條件［7～9］的報(bào)道，但尚未見工業(yè)化應(yīng)用。溴乙錠誘導(dǎo)酵母細(xì)胞產(chǎn)生限制線粒體呼吸作用的變異菌株［10］，增加酵母態(tài)細(xì)胞數(shù)量［11］，能有效提高普魯蘭多糖的合成效率，溴乙錠在誘變處理中對(duì)細(xì)胞無致死作用，不改變細(xì)胞代謝途徑。作者采用溴乙錠對(duì)出芽短梗霉進(jìn)行誘變處理，得到一株變異菌株，并研究了其產(chǎn)普魯蘭粗多糖情況。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種

出芽短梗霉3.2756，由武漢生物工程學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，水1000 m L。

改良PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）100 g，葡萄糖10 g，瓊脂15 g，水1000 m L。

液體培養(yǎng)基：葡萄糖2.5～10 g，（NH4）2SO40.1 g，K2HPO40.2 g，酵母膏0.04 g，NaCl 0.1 g，Mg－SO4·7 H2O 0.04 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001 g，加水至100 m L，p H 值6.5，0.1 MPa滅菌15 min。

培養(yǎng)方法：培養(yǎng)溫度為（27±2）℃，斜面活化和平板培養(yǎng)用PDA培養(yǎng)基，斜面培養(yǎng)48 h后4℃冰箱保存。用含葡萄糖2.5%的液體培養(yǎng)基試管培養(yǎng)48 h后，接入裝有45 m L含葡萄糖10%的液體培養(yǎng)基的250 m L三角瓶中，接種量2%，200 r·min－1搖瓶培養(yǎng)24 h。

1.3 誘變處理

取搖瓶培養(yǎng)液10 m L，加入到90 m L含40μg溴乙錠的液體培養(yǎng)基中，25～27℃下分別：（1）200 r·min－1培養(yǎng)4 h；（2）200 r·min－1培養(yǎng)4 h后靜置48 h。將培養(yǎng)液用生理鹽水梯度稀釋，取稀釋度為10－3、10－4、10－5、10－6的培養(yǎng)液涂布平板，菌落編號(hào)轉(zhuǎn)入斜面培養(yǎng)。

1.4 粗多糖的提取

取發(fā)酵液于4000 r·min－1離心30 min，分離菌體，上清液加入3 BV乙醇沉淀，于3000 r·min－1離心15 min，沉淀用去離子水溶解后再用3 BV乙醇沉淀，過濾烘干至恒重，得普魯蘭粗多糖。菌體用去離子水洗滌，再用0.45μm膜過濾，濾渣用去離子水洗滌，烘干至恒重為菌體干重。按下式計(jì)算多糖轉(zhuǎn)化率：

2 結(jié)果與討論

2.1 出發(fā)菌株的培養(yǎng)與優(yōu)化

不同的出芽短梗霉菌株菌落外觀、發(fā)酵液和多糖的色澤各有不同［12］，普遍認(rèn)為菌株3.2756、3.3984有較好的產(chǎn)普魯蘭潛力。出芽短梗霉生長(zhǎng)過程有多種細(xì)胞形態(tài)［13］，酵母態(tài)細(xì)胞是生成普魯蘭的主要細(xì)胞形態(tài)［14］。

菌株3.2756液體培養(yǎng)形成菌絲和大小不一的酵母態(tài)細(xì)胞，并形成菌絲團(tuán)和菌體球，表面覆蓋粘狀物，搖瓶培養(yǎng)120 h后，平板培養(yǎng)菌落表面皺縮，即開始生成厚垣孢子。

液體培養(yǎng)普魯蘭粗多糖產(chǎn)量隨葡萄糖含量增加而升高，粗多糖轉(zhuǎn)化率隨葡萄糖含量不同而變化。用含葡萄糖10%的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，粗多糖產(chǎn)量最高為11.07 g·L－1（圖1）。發(fā)酵液深褐色至黑色，發(fā)酵終p H值2.5～2.7，粗多糖黑色。

對(duì)菌株3.2756用PDA平板反復(fù)分離篩選，得到一株自然突變株BE1－6，菌落由初期的深褐色逐漸變?yōu)樯铧S綠色至黑色，之后全部轉(zhuǎn)化為黑色。搖瓶培養(yǎng)酵母態(tài)細(xì)胞增加，發(fā)酵液灰白色，發(fā)酵終p H值4.5～4.7，粗多糖黑色。用含葡萄糖10%的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，粗多糖產(chǎn)量27.13 g·L－1。

圖1 菌株3.2756培養(yǎng)時(shí)間與菌體干重及粗多糖產(chǎn)量的關(guān)系Fig.1 The relationship between culture time and dry cell weight，crude polysaccharide production for strain 3.2756

2.2 溴乙錠誘變處理結(jié)果

將菌株BE1－6用溴乙錠誘變處理，（1）法處理獲得菌株粗多糖產(chǎn)量比BE1－6略高，其它無明顯差異；（2）法處理后分離得到一株變異株BM2－5，菌落呈白色，有時(shí)泛淺粉紅色，4℃保藏7 d后逐漸出現(xiàn)黑色，1個(gè)月后菌落全部轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏Ｓ酶牧糚DA培養(yǎng)基保藏，菌落出現(xiàn)黑色時(shí)間推遲。菌株BM2－5發(fā)酵液細(xì)胞全部為酵母態(tài)，細(xì)胞大小不到原酵母態(tài)細(xì)胞的1／10，發(fā)酵液白色，發(fā)酵終p H值4.5～4.7，粗多糖白色。用含葡萄糖10%的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，粗多糖產(chǎn)量47.82 g·L－1。用不同含量葡萄糖發(fā)酵，多糖轉(zhuǎn)化率差異不明顯。連續(xù)培養(yǎng)8次以上，粗多糖產(chǎn)量差異不明顯。3株菌的特征及粗多糖產(chǎn)量比較見表1。

表1 不同菌株的特征及粗多糖產(chǎn)量比較Tab.1 The comparison of characteristic and crude polysaccharide production of different strains

2.3 誘變菌株BM2－5發(fā)酵產(chǎn)糖結(jié)果

以大米酶解葡萄糖為碳源或以玉米漿代替酵母膏，多糖產(chǎn)量均有提高。菌株BM2－5在大米酶解葡萄糖10%、（NH4）2SO40.1%、K2HPO40.2%、玉米漿0.1%、NaCl 0.1%、MgSO4·7H2O 0.04%、FeSO4·7H2O 0.001%、自然p H 值的培養(yǎng)基中，200 r·min－1搖瓶培養(yǎng)72 h，粗多糖產(chǎn)量最高，為66.37 g·L－1。

菌株用改良PDA培養(yǎng)基保藏時(shí)間不超過5 d、活化斜面保藏時(shí)間不超過24 h，200 r·min－1搖瓶培養(yǎng)72 h，粗多糖產(chǎn)量最高，為68.06 g·L－1（圖2）。

圖2 菌株BM2－5培養(yǎng)時(shí)間與菌體干重及粗多糖產(chǎn)量的關(guān)系Fig.2 The relationship between culture time and dry cell weight，crude polysaccharide production for strain BM2－5

用2 L發(fā)酵罐裝料1 L，培養(yǎng)基為淀粉糊精（DE35）10%、K2HPO40.2%、蛋白胨 0.2%、NaCl 0.1%、MgSO4·7H2O 0.04%，在通風(fēng)量為0.5 L·min－1、攪拌轉(zhuǎn)速為350 r·min－1、（27±1）℃、罐壓為0.1～0.65 kPa的條件下，粗多糖產(chǎn)量為47.8 g·L－1。

3 結(jié)論

在自然育種的基礎(chǔ)上用溴乙錠對(duì)出芽短梗霉進(jìn)行誘變，得到菌落及細(xì)胞外觀差異明顯、普魯蘭粗多糖產(chǎn)量大幅提高的誘變株BM2－5，在大米酶解葡萄糖10%、（NH4）2SO40.1%、K2HPO40.2%、玉 米 漿0.1%、NaCl 0.1%、MgSO4·7H2O 0.04%、FeSO4·7H2O 0.001%、p H 值自然的培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)72 h，得到白色的粗多糖，產(chǎn)量最高為68.06 g·L－1。

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Ethidium Bromide Induced Mutation ofAureobasidium Pullulans

HU Hong－sen，YE Bin
（Department of Biotechnology，Wuhan Biotechnology Institute，Wuhan430415，China）

Aureobasidium pullulanswas mutagenized by ethidium bromide，and a pigment－free mutant BM2－5 was obtained，for which the cells were of yeast－like form in liquid fermentation.When BM2－5 was cultured at 27℃and 200 r·min－1for 72 h in the liquid culture medium with enzymatic hydrolyzed rice glucose as carbon source，the maximum pullulan polysaccharide production was 68.06 g·L－1.

Aureobasidium pullulans；mutagenesis；ethidium bromide；pullulan

TS 261.1

A

1672－5425（2012）11－0061－03

10.3969／j.issn.1672－5425.2012.11.017

2012－08－06

胡洪森（1966－），男，湖北鄂州人，高級(jí)工程師，研究方向：食品發(fā)酵技術(shù)，E－mail：huhsm＠163.com。