周 艷，徐 艷

(1.市口腔醫(yī)院，江蘇南通 226001;2.南京醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)研究所，江蘇南京 210029;3.南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周科，江蘇南京 210029)

在牙周炎病變過(guò)程中，牙周支持組織的喪失一方面是由于致病菌產(chǎn)生的酶和毒素造成的直接損害，另一方面是過(guò)度的宿主免疫反應(yīng)造成繼發(fā)性損傷。病原微生物作用于牙周組織單核巨噬細(xì)胞，可分泌出多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子與牙槽骨破壞吸收有著密切關(guān)系，其中 IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、IL-11、TNF-α、HGF等細(xì)胞因子在牙周炎病變中的作用已經(jīng)被廣泛研究與證實(shí)［1-2］。Th17型細(xì)胞因子是一類(lèi)新近發(fā)現(xiàn)的前炎癥因子功能家族，包括IL-17、IL-21、IL-22等，以往的研究已證實(shí)，這些細(xì)胞因子在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、炎癥性腸病等炎癥和自身免疫性疾病中，起到關(guān)鍵和重要的致病作用［3-7］，但在CP的炎性免疫反應(yīng)中的研究尚未深入。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)CP病人牙周基礎(chǔ)治療前后齦溝液中Th17型細(xì)胞因子(IL-17、IL-21)的濃度變化，以及外周血CD4+T細(xì)胞中Th17的特異性轉(zhuǎn)錄因子RORC的表達(dá)水平，以期探討Th17型細(xì)胞因子在CP發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

2008-10—2009-03從南通市口腔醫(yī)院牙周科診斷為牙周炎的病人中選擇受試者30例，其中男性19例，女性11例，年齡30～61歲，每例病人均選擇1個(gè)第一磨牙作為研究牙(個(gè)別第一磨牙不符合納入標(biāo)準(zhǔn)者用相鄰的第二磨牙代替)。所有受試者均知情同意。納入標(biāo)準(zhǔn):①身體健康，無(wú)全身性疾病;②無(wú)吸煙史;③口內(nèi)余留牙不少于20個(gè);④過(guò)去6個(gè)月內(nèi)無(wú)牙周治療史;⑤過(guò)去3個(gè)月內(nèi)無(wú)抗生素、非甾體類(lèi)抗炎藥及免疫抑制劑應(yīng)用史;⑥婦女未妊娠。研究牙納入標(biāo)準(zhǔn):①無(wú)牙髓及根尖周病變;②無(wú)咬合創(chuàng)傷;③無(wú)不良修復(fù)體;④無(wú)Ⅱ度以上根分叉病變;⑤3 mm≤牙周探診深度(PD)≤8 mm。

1.2 臨床指標(biāo)檢查和基礎(chǔ)治療

采用L?e和Silness法檢查研究牙位的菌斑指數(shù)(PLI)、牙齦指數(shù)(GI)、探診深度(PD)和臨床附著水平(CAL)等牙周臨床指標(biāo)。然后根據(jù)牙周基礎(chǔ)治療計(jì)劃接受詳細(xì)的口腔衛(wèi)生指導(dǎo)、全口齦上潔治、齦下刮治和根面平整。治療結(jié)束后6周復(fù)查，再次并作牙周臨床指標(biāo)檢查。

1.3 齦溝液中Th17型細(xì)胞因子濃度檢測(cè)

分別于基礎(chǔ)治療前和治療后6周，早餐后2～3 h，采集所有病人研究牙的齦溝液。研究牙以棉卷隔濕，輕吹牙齦 1 min后，將消毒的濾紙條(2 mm×20 mm)輕輕插入齦溝或牙周袋內(nèi)，遇阻力即止，停留30 s取出(如被血污染則棄除)，用Sartorius BS124S分析天平(誤差d=0.0001 g)稱(chēng)重，按比重為1換算成體積。稱(chēng)重后樣本立即放入200 μL磷酸鹽緩沖液(PBS)中，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)齦溝液中的IL-17、IL-21，操作按R＆D的Human ELISA Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 外周血CD4+T細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子RORC表達(dá)水平檢測(cè)

分別于基礎(chǔ)治療前和治療后6周采集所有病人外周血，以密度梯度離心法進(jìn)行單核細(xì)胞分離;吸取單核細(xì)胞層，根據(jù)MACS CD4+T MicroBeads(Militenyi Biotec公司)操作說(shuō)明，對(duì)外周血CD4+T細(xì)胞進(jìn)行免疫磁珠分選;采用試劑盒(Rneasy Mini Kit，Qiagen公司)進(jìn)行RNA的抽提及逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA;采用熒光定量PCR法檢測(cè)外周血CD4+T細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子RORC表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，牙周基礎(chǔ)治療前后齦溝液中細(xì)胞因子水平及外周血轉(zhuǎn)錄因子水平比較用配對(duì)t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 基礎(chǔ)治療前后牙周臨床指標(biāo)的變化

基礎(chǔ)治療后，所有牙周臨床指標(biāo)(PLI、GI、PD、AL)均較治療前顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明牙周臨床癥狀明顯改善(表1)。

表1 牙周基礎(chǔ)治療前后各臨床指標(biāo)比較()

*與治療前相比P＜0.05

PLI GI PD CAL組別 牙數(shù)治療前30 2.66 ±0.37 1.98 ±0.08 4.73 ±0.84 5.73 ±1.47治療后 30 0.43 ±0.24*0.51 ±0.27*3.25 ±0.67*4.52 ±1.17*

2.2 牙周基礎(chǔ)治療前后齦溝液中Th17型細(xì)胞因子(IL-17、IL-21)水平變化

牙周基礎(chǔ)治療后齦溝液中IL-17和IL-21水平均較治療前顯著下降(P＜0.05)，其中IL-17從治療前的(63.4731±19.4746)ng/mL降至(40.0069±10.9361)ng/mL。IL-21 從治療前的(80.4143 ± 39.4763)ng/mL 降 至 (31.6151 ±13.1908)ng/mL(圖1)。

2.3 牙周基礎(chǔ)治療前后外周血CD4+T細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)變化

利用MACS免疫磁珠分選技術(shù)將CD4+T細(xì)胞分選出后，抽提RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再行Realtime PCR，發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)治療后外周血CD4+T中Th17特異性轉(zhuǎn)錄因子RORC表達(dá)水平從治療前的0.7099±0.1455下降至 0.3661 ± 0.1308，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖2)。

圖2 牙周基礎(chǔ)治療前后外周血CD4+T細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子RORC的表達(dá)的比較(*與治療前相比P＜0.05)

3 討論

機(jī)體的免疫防御系統(tǒng)在牙周炎的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，在過(guò)去的二十年中，一直運(yùn)用Th1/Th2理論體系來(lái)解釋牙周炎的免疫學(xué)機(jī)制，然而Th1/Th2在慢性牙周炎發(fā)病機(jī)制中誰(shuí)占主導(dǎo)地位一直存在爭(zhēng)論［8-9］，直到Th17型細(xì)胞因子的發(fā)現(xiàn)和確立，才補(bǔ)充了牙周炎發(fā)病機(jī)制中缺失的重要一環(huán)。Thl7型細(xì)胞因子包括 IL-17、IL-21、IL-22、IL-6、TNF-α等，是一類(lèi)新近發(fā)現(xiàn)的前炎癥因子功能家族，其中IL-17是Th17型細(xì)胞因子中的一個(gè)最關(guān)鍵的促炎癥性細(xì)胞因子［10］，具有強(qiáng)大的招募中性粒細(xì)胞的作用，調(diào)節(jié)并促進(jìn)多種炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，參與機(jī)體多種炎性疾病，與感染、腫瘤、過(guò)敏、移植及自身免疫性疾病均有密切關(guān)系［11-12］。

IL-17受體(IL-17R)屬于I型跨膜蛋白，分布廣泛，幾乎所有類(lèi)型的細(xì)胞均有表達(dá)。IL-17具有強(qiáng)大的致炎性，作用十分廣泛。大量實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，IL-17在局部組織炎癥中的作用主要通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞釋放前炎癥因子及動(dòng)員中性粒細(xì)胞的細(xì)胞因子而發(fā)揮作用［13］。而且，它還可引起中性粒細(xì)胞蛋白酶和髓過(guò)氧化物酶等蛋白水解酶活性增高，提高CXC趨化因子等細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)中性粒細(xì)胞的聚集。IL-21作為T(mén)h17細(xì)胞的一種自分泌調(diào)節(jié)因子，在誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化、抑制Th1、Treg功能方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。

盡管以IL-17為代表的Th17型細(xì)胞因子在牙周疾病免疫機(jī)制中作用的研究剛剛開(kāi)始，仍然不斷有增加的證據(jù)支持Th17型細(xì)胞因子在慢性牙周炎發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。如 Cardoso等［14］在慢性牙周炎牙周組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)有Th17細(xì)胞的浸潤(rùn)。Johnson等［15］研究發(fā)現(xiàn)，在治療前，慢性牙周炎病人齦溝液中IL-17的水平較正常人明顯上升。Oda等［16］實(shí)驗(yàn)證實(shí)，慢性牙周炎的主要致病菌牙齦卟啉單胞菌能夠促進(jìn)CD4+T細(xì)胞分泌IL-17，從而誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)CP病人牙周基礎(chǔ)治療前后齦溝液中Th17型細(xì)胞因子(IL-17、IL-21)濃度變化的研究發(fā)現(xiàn)，炎癥牙位治療后的齦溝液中Th17型細(xì)胞因子(IL-17、IL-21)濃度較治療前明顯下降，此結(jié)果與上述學(xué)者的研究結(jié)論一致。

Th17的分化前體細(xì)胞為初始CD4+T祖細(xì)胞——ThP細(xì)胞，ThP細(xì)胞在特定環(huán)境中向不同細(xì)胞亞群分化，轉(zhuǎn)錄因子在CD4+T輔助細(xì)胞的分化過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，RORC為T(mén)h17細(xì)胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子。為了進(jìn)一步闡明Th17型細(xì)胞因子在CP病人治療前后的變化規(guī)律，我們利用Real-time PCR檢測(cè)該實(shí)驗(yàn)中CP病人外周血CD4+T細(xì)胞中 RORC轉(zhuǎn)錄水平的變化，發(fā)現(xiàn)RORC在牙周基礎(chǔ)治療前后表達(dá)水平發(fā)生了顯著下降，這與齦溝液中 Th17型細(xì)胞因子(IL-17、IL-21)在治療前后的變化相一致。

牙周基礎(chǔ)治療是對(duì)每個(gè)牙周炎病人都適用的最基本的治療方法［17］，也是最有效的治療方法。經(jīng)基礎(chǔ)治療后6周復(fù)查，所有研究牙位的牙周臨床指數(shù)(PLI、GI、PD、CAL)均較治療前顯著下降，表明牙周臨床癥狀明顯改善。本研究采用CP病人牙周基礎(chǔ)治療前后的牙位作為研究對(duì)象，排除了全身免疫因素的影響，同一牙位治療前后齦溝液中IL-17濃度的顯著下降有力的支持了IL-17在牙周組織炎癥中的作用［15］。

本結(jié)果表明:慢性牙周炎病人齦溝液中Th17型細(xì)胞因子IL-17、IL-21在炎癥期水平上調(diào)，在治療后隨著牙周臨床指標(biāo)顯著好轉(zhuǎn)，炎癥明顯消退，濃度水平顯著下降;慢性牙周炎外周血CD4+T細(xì)胞中Th17轉(zhuǎn)錄因子RORC在基礎(chǔ)治療后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這與慢性牙周炎病人齦溝液中Th17型細(xì)胞因子(IL-17、IL-21)在牙周基礎(chǔ)治療前后的變化相一致。提示Th17型細(xì)胞因子具有重要的致炎作用，并參與了慢性牙周炎病變的發(fā)生發(fā)展。

［1］張小恒，張國(guó)英.齦溝液中與牙周病有關(guān)的細(xì)胞因子的研究進(jìn)展［J］.國(guó)際口腔醫(yī)學(xué)雜志，2008，35(1):19-21.

［2］陳智濱，孫曉軍，寇傳哲，等.齦溝液微量樣本中多種成分的檢測(cè)［J］.北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2008，40(1):57-59.

［3］Hashimoto T，Akiyama L，Kobayashi N，et al.Comparison of IL-17 production by helper T cells among atopic and nonatopic asthmatics and control subjects.Int Arch Allergy Immunol，2005，137(Suppl.1):51-54.

［4］Maini RN，Taylor PC，Szechinski J，et al.Double-blind randomized controlled clinical trial of the interleukin-6 receptor antagonist，tocilizumab，in European patients with rheumatoid arthritis who had an incomplete response to methotrexate［J］.Arthritis Rheum，2006，54(9):28l7-2829.

［5］Wong CK，Ho CY，Li EK，et al.Elevation of proinflammatory cytokine(IL-18，IL-I7，IL-12)and Th2 cytokine(IL-4)concentrations in patients with systemic lupus erythematosus［J］.Lupus，2000，9(8):589-593.

［6］Matusevicius D，Kivisakk P，He B，et al.Interleukin-17 mRNA expression in blood and CSF mononuclear cells is augmented in multiple sclerosis［J］.Mult Scler，1999，5(2):101-104.

［7］Linden A，Hoshino H，Laan M.Airway neutrophils and interleukin-17［J］.Eur Respir J，2000，15(5):973-977.

［8］Bartova J，Kratka-Opatrna Z，Prochazkova J，et al.Th1 and Th2 cytokine profile in patients with early onset periodontitis and their healthy siblings［J］.Mediators Inflamm，2000，9(2):115-120.

［9］Lappin DF，MacLeod CP，Kerr A，et al.Antiinflammatory cytokine IL-10 and T cell cytokine profile in periodontitis granulation tissue［J］.Clin Exp Immunol，2001，123(2):294-300.

［10］Gaffen SL，Kramer JM，Yu JJ，et al.The IL-17 cytokine family［J］.Vitam Horm，2006，74:255-282.

［11］Matsuzaki G，Umemura M.Interleukin-17 as an effector molecule of innate and acquired immunity against infections［J］.Microbiol Immunol，2007，51(12):1139-1147.

［12］Yu JJ，Gaffen SL.Interleukin-17:a novel inflammatory cytokine that bridges innate and adaptive immunity［J］.Front Biosci，2008，13:170-177.

［13］Christopher MJ，Link DC.Regulation of neutrophil homeostasis［J］.Curr Opin Hematol，2007，14(1):3-8.

［14］Cardoso CR，Garlet GP，Crippa GE，et al.Evidence of the presence of T helper type 17 cells in chronic lesions of human periodontal disease［J］.Oral Microbiol Immunol，2009，24(1):1-6.

［15］Johnson RB，Wood N，Serio FG.Interleukin-11 and IL-17 and the pathogenesis of periodontal disease［J］.J Periodontol，2004，75(1):37-43.

［16］Oda T，Yoshie H，Yamazaki K.Porphyromonas gingivalis antigen preferentially stimulates T cells to express IL-17 but not receptor activator of NF-kappaB ligand in vitro［J］.Oral Microbiol Immunol，2003，18(1):30-36.

［17］曹采方.牙周病學(xué)［M］.2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2003:165.