許文頻， 沈 楠， 張二娟， 李 敏， 李衛(wèi)東

(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系， 北京 100191)

1000-4718(2012)07-1287-05

2012-02-01

2012-04-12

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81173069)；北京市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.7102100)

△ 通訊作者 Tel: 010-82802798；E-mail: lwdpharma@126.com

細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子3在小鼠腎炎進(jìn)程中的表達(dá)*

許文頻， 沈 楠， 張二娟， 李 敏， 李衛(wèi)東△

(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系， 北京 100191)

目的探索細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子3(SOCS3)在小鼠腎炎進(jìn)程中的表達(dá)變化規(guī)律和意義。方法采用含兔抗小鼠腎小球基底膜抗體的腎毒素血清(NTS)制備小鼠腎炎模型。在第10、15、20和25 d分別收集小鼠尿液并摘取腎臟。以蛋白尿水平、腎臟組織HE和Masson染色評(píng)價(jià)腎炎進(jìn)程；采用免疫組化和Western blotting 法檢測(cè)SOCS3蛋白表達(dá)變化，以及Janus激酶2(JAK2)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)在小鼠腎炎進(jìn)程中磷酸化情況。結(jié)果小鼠腎炎模型表現(xiàn)出典型的發(fā)病、進(jìn)展與轉(zhuǎn)歸；SOCS3在腎炎進(jìn)程中未出現(xiàn)立即隨JAK2和STAT3磷酸化增多而表達(dá)增加的現(xiàn)象，僅在腎炎嚴(yán)重期(第20 d)表達(dá)增加(P<0.05)，在恢復(fù)期(第25 d)表達(dá)明顯增加(P<0.01)?；謴?fù)期SOCS3表達(dá)顯著增加，表現(xiàn)出抑制JAK2和STAT3磷酸化的作用。結(jié)論機(jī)體自身?xiàng)l件下，SOCS3的表達(dá)未立即隨JAK2/STAT3磷酸化增多而增加，SOCS3對(duì)免疫性腎炎的保護(hù)作用可能主要在腎炎恢復(fù)期。

細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子； 腎毒素血清； 負(fù)調(diào)控； 信號(hào)通路

細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子(suppressor of cytokine signaling, SOCS)家族是以SH2結(jié)構(gòu)域?yàn)楹诵慕Y(jié)構(gòu)，C端具有保守的40個(gè)氨基酸模塊——SOCS盒的胞漿蛋白分子家族[1]。該家族可在多種細(xì)胞內(nèi)表達(dá)或誘導(dǎo)表達(dá)。該家族主要功能的發(fā)揮是通過蛋白中SH2結(jié)構(gòu)與Janus激酶(Janus kinase，JAK)或細(xì)胞因子受體中磷酸化的酪氨酸相結(jié)合，抑制細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。 SOCS3作為SOCS家族的重要分子，目前已有大量研究表明其可被多種炎癥因子和抗炎因子誘導(dǎo)表達(dá)，如白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)、白細(xì)胞介素10(interleukin-10，IL-10)、干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)、脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)等，從而負(fù)調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)而避免機(jī)體遭受免疫損傷[2]。炎癥刺激產(chǎn)生的IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)等炎癥因子通過細(xì)胞膜表面受體激活JAK2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal trainsducer and activator of transcription 3,STAT3)，引起SOCS3的表達(dá)增多，是SOCS3表達(dá)上調(diào)的重要途徑[3]。

免疫性腎炎是免疫性疾病中最嚴(yán)重的病癥之一，該病患者的生活質(zhì)量嚴(yán)重受影響。該疾病的重要病因是腎小球基底膜抗原抗體復(fù)合物沉積或?qū)ψ陨砜乖a(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)，引起自身免疫細(xì)胞攻擊而導(dǎo)致腎組織損傷。在腎炎損傷過程中SOCS3分子的表達(dá)情況，以及JAK2-STAT3-SOCS3信號(hào)通路在疾病發(fā)病過程中的作用未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以小鼠腎毒素血清(nephrotoxic sera，NTS)性腎炎模型[4]為基礎(chǔ)，通過調(diào)節(jié)NTS劑量，得到可自愈的小鼠腎炎模型，以研究SOCS3分子在該病進(jìn)程不同時(shí)點(diǎn)的表達(dá)規(guī)律和意義。

材 料 和 方 法

1動(dòng)物

日本大耳兔3只，雄性，體重2.5 kg，C57BL/6小鼠40只，雌性，體重18～20 g，均由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2主要試劑

兔抗鼠SOCS3Ⅰ抗、兔抗鼠JAK2Ⅰ抗、兔抗鼠p-JAK2Ⅰ抗、兔抗鼠STAT3Ⅰ抗、兔抗鼠p-STAT3Ⅰ抗和HRP標(biāo)記抗兔Ⅱ抗為Cell Signaling Technology產(chǎn)品；羊抗鼠SOCS3Ⅰ抗為Santa Cruz產(chǎn)品； HRP標(biāo)記抗羊免疫組化檢測(cè)Ⅱ抗和DAB顯色試劑盒為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；完全弗氏佐劑、兔IgG和NP-40為Sigma產(chǎn)品；苯甲基磺酰氟(phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF)、抑肽酶(aprotinin)和亮抑酶肽(leupeptin)為Amresco產(chǎn)品。ECL試劑盒為Thermo產(chǎn)品；Masson染色試劑盒為福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品。

3方法

3.1小鼠NTS的制備[4]取C57BL/6小鼠腎皮質(zhì)，研磨過60、80、200目細(xì)胞篩，在200目細(xì)胞篩上面收集腎小球，將腎小球勻漿后制成混懸液。取腎小球勻漿液(蛋白濃度：200 g/L)與弗氏完全佐劑1∶1混合于第1、7和21 d皮下注射免疫兔，于第50 d收集兔血清即為NTS，檢測(cè)NTS中總IgG含量。

3.2分組及造模 40只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為2

組，每組20只，即對(duì)照組和模型組。小鼠腎炎的制備：皮下注射兔IgG(250 μg/只)和弗氏完全佐劑混合液，于第4、5和6 d分別靜脈注射給予NTS(100 μg總IgG/只)。對(duì)照組用空白兔血清取代NTS，其它處理與模型相同。分別于第10、15、20和25 d每個(gè)時(shí)點(diǎn)隨機(jī)選擇5只小鼠，體外壓迫膀胱法收集小鼠尿液，然后斷頭處死，摘取腎臟。

3.3小鼠尿蛋白檢測(cè) 考馬斯亮藍(lán)G250染色法檢測(cè)小鼠尿蛋白含量。

3.4腎組織病理檢測(cè) 取小鼠腎臟于液氮冷凍30 s后用OTC包埋，冰凍切片機(jī)切片，片厚6 μm。HE染色，Masson染色(步驟參照試劑盒說明書)，觀察腎組織病理變化。

3.5腎組織兔抗小鼠腎小球抗體沉積檢測(cè) 用HRP標(biāo)記的抗兔抗體孵育，DAB顯色，觀察兔抗鼠腎小球基底膜抗體沉積情況。

3.6腎臟JAK2-STAT3-SOCS3信號(hào)通路相關(guān)蛋白檢測(cè)

3.6.1免疫組化方法檢測(cè)腎臟冰凍切片SOCS3的表達(dá) 兩步法檢測(cè)：取腎組織冰凍切片，丙酮固定后，37 ℃烤片3 h，3%過氧化氫孵育10 min，BSA封閉1 h，Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，Ⅱ抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色，用Image-Pro Plus軟件半定量分析。

3.6.2Western blotting檢測(cè)小鼠腎臟SOCS3表達(dá)和JAK2、STAT3磷酸化 組織蛋白提?。耗I臟組織100 mg加入500 mL蛋白裂解液中，勻漿器勻漿，12 000×g4 ℃離心20 min取上清，考馬斯亮藍(lán)G250染色法檢測(cè)蛋白含量，分裝后-80 ℃凍存。取蛋白，用裂解液調(diào)蛋白濃度至每組相等，加入5×loading buffer， 沸水煮6 min。取蛋白60 μg進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，BSA封閉1 h，Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，Ⅱ抗室溫孵育1 h，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescence，ECL)檢測(cè)，Bio-Rad軟件半定量分析。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1NTS腎炎模型病程中尿蛋白水平變化

與對(duì)照組比較，第15、20和25 d模型組蛋白尿水平均明顯升高(P<0.01)，提示腎臟功能在第15 d即有損傷，見圖1。

圖1制備模型后不同時(shí)點(diǎn)小鼠尿蛋白水平的變化

2NTS腎炎模型病程中腎組織病理改變

HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠腎小球囊間隙清楚，腎小管排列規(guī)則。模型組第10 d小鼠腎組織有炎癥細(xì)胞浸潤，但炎癥損傷和間質(zhì)水腫均不明顯，在第15和20 d可以看到大量的炎癥細(xì)胞浸潤，腎間質(zhì)嚴(yán)重水腫，腎小囊與周圍組織粘黏，部分腎小球萎縮，部分腎小球因代償作用而增大。第25 d可以看到間質(zhì)水腫降低，腎小球周圍炎癥細(xì)胞浸潤減少，炎癥似進(jìn)入恢復(fù)期，見圖2。

Masson染色結(jié)果顯示，不同時(shí)點(diǎn)的模型組比對(duì)照組腎小球周圍纖維增多不明顯，在第20和25 d中腎小球出現(xiàn)部分硬化,說明本次炎癥損傷以間質(zhì)水腫為主，腎小球硬化主要為局部硬化，纖維化不明顯，見圖3。

Figure 2. HE staining of mouse kidney tissues. A: control group； B:model group (day 10)； C: model group (day 15)； D: model group (day 20)； E: model group (day 25).

圖2小鼠腎組織HE染色

Figure 3. Masson staining of mouse kidney tissues. A: control group； B:model group (day 10)； C: model group (day 15)； D: mo-del group (day 20)； E: model group (day 25).

圖3小鼠腎組織Masson染色

3NTS腎炎模型病程中兔抗小鼠腎小球基底膜抗體沉積情況

模型組第10 d開始便呈現(xiàn)抗腎小球基底膜抗體明顯沉積，并且在腎炎過程中沉積情況類似，模型組第10、15、20和25 d各時(shí)點(diǎn)沉積情況無明顯差別，見圖4。

4NTS腎炎模型病程中JAK2-STAT3-SOCS3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

4.1免疫組化結(jié)果顯示，腎臟組織SOCS3蛋白免疫組化染色表現(xiàn)棕色部分逐漸增多，第25 d最為明顯，如圖5。

4.2Western blotting 結(jié)果表明，腎炎開始階段第10和15 d，JAK2/STAT3磷酸化明顯升高(P<0.01)，但此時(shí)SOCS3的升高無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。腎

炎轉(zhuǎn)歸期(第25 d)，SOCS3表達(dá)顯著增多(P<0.01)，見圖6。

Figure 4. The glomerular deposits of rabbit immunoglobulin with immunohistochemical staining. A: control group； B:model group (day 15).

圖4免疫組化染色檢測(cè)小鼠腎小球兔免疫球蛋白沉積

圖5免疫組化染色檢測(cè)腎組織SOCS3表達(dá)

圖6Westernblotting檢測(cè)腎組織SOCS3表達(dá)以及JAK2/STAT3磷酸化情況

討 論

免疫性腎炎病程漫長，發(fā)病機(jī)制與自身免疫系統(tǒng)對(duì)腎組織損傷相關(guān)。目前常用的自發(fā)性免疫性腎炎動(dòng)物模型如BXSB、MRL/lpr小鼠等，這些腎炎模型隨小鼠月齡增加日益嚴(yán)重，最終死亡，沒有出現(xiàn)腎炎轉(zhuǎn)歸，愈合。而人類腎炎疾病多數(shù)是發(fā)病在一定期間內(nèi)愈合。NTS鼠腎炎模型是通過靜脈注入含有抗鼠腎小球基底膜抗體的腎毒素血清，通過抗原抗體反應(yīng)而誘導(dǎo)的自身免疫系統(tǒng)損傷腎臟組織，而誘發(fā)的腎炎模型，病因清楚，條件可控。本實(shí)驗(yàn)通過調(diào)節(jié)NTS的劑量而制備出可以在一定時(shí)間內(nèi)自愈的腎炎模型。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮诘?0 d沒有出現(xiàn)明顯腎炎損傷，而在第15和20 d時(shí)出現(xiàn)顯著腎臟病理改變，并且炎癥損傷在第25 d時(shí)有消退趨勢(shì)，模擬了可自愈的免疫性腎炎的過程，因而可以觀察在整個(gè)腎炎發(fā)病過程中目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況。本模型由于時(shí)間較短，腎炎的損傷以急性損傷為主，主要表現(xiàn)為間質(zhì)水腫，腎小球與周圍組織黏連，部分腎小球萎縮、硬化,纖維化不是很明顯。本實(shí)驗(yàn)中JAK2/STAT3在腎炎的發(fā)展過程中出現(xiàn)隨炎癥程度增高而激活增加的趨勢(shì)。SOCS3并沒有表現(xiàn)出此趨勢(shì)，而在炎癥損傷最為嚴(yán)重的第20 d表達(dá)增加，并在炎癥開始消退的第25 d顯著增加。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示我們SOCS3在腎炎愈合期發(fā)揮重要作用，這也說明免疫性腎炎自我恢復(fù)是有自身信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)調(diào)控參與的，而且負(fù)調(diào)控的啟動(dòng)可能與炎癥的發(fā)生有時(shí)間差，或者達(dá)炎癥刺激閾值才能誘導(dǎo)有效地負(fù)調(diào)控應(yīng)答反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)免疫組化結(jié)果表明SOCS3在第15 d表達(dá)增加也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但Western blotting檢測(cè)沒有統(tǒng)一的結(jié)果，說明可能是SOCS3在第15 d也有局部增高現(xiàn)象，但對(duì)于整個(gè)腎臟來說增高不是很明顯，SOCS3的表達(dá)可能由于局部炎癥差異而出現(xiàn)表達(dá)變化。

目前腎炎的主要治療方法是抗感染、利尿、抑制免疫[5]、阻斷特異免疫細(xì)胞功能[6]、嚴(yán)重者進(jìn)行透析等。研究[7]已發(fā)現(xiàn)JAK/STAT 信號(hào)通路與腎炎有重要關(guān)系，并且通過AG490阻斷可以緩解癥狀，延長模型鼠壽命。本實(shí)驗(yàn)提示我們，提高腎組織SOCS3的表達(dá)，可能為治療腎炎的有效方法。如果找到可以提高腎組織SOCS3的藥物，可有效縮短腎炎過程，促使該疾病早日康復(fù)。在其它的免疫類疾病中如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、免疫性肝炎，外源性補(bǔ)充SOCS3表現(xiàn)出良好治療作用[3, 8]。這提示我們外源性補(bǔ)充 SOCS3可能也是治愈腎炎的有效手段。JAK-STAT信號(hào)通路在糖尿病腎病中高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化也發(fā)揮重要作用[9]，作為負(fù)調(diào)控蛋白SOCS3對(duì)于糖尿病腎病可能也會(huì)有治療作用。

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Expressionofsuppressorofcytokinesignaling3duringthecourseofmousenephritis

XU Wen-pin, SHEN Nan, ZHANG Er-juan, LI Min, LI Wei-dong

(DepartmentofPharmacology,SchoolofBasicMedicalSciences,PekingUniversityHealthScienceCenter,Beijing100191,China.E-mail:lwdpharma@126.com)

AIM: To explore the expression and role of suppressor of cytokine signaling 3 (SOCS3) in mouse nephritis.METHODSC57BL/6 mice were challenged with rabbit anti-mouse glomerular basement membrane nephrotoxic sera (NTS) to induce immune nephritis. On days 10, 15, 20 and 25, the urine samples from the mice were collected, and the kidneys were also harvested. The degree of proteinuria and the changes of renal pathology were detected to assess the course of nephritis. The expression of SOCS3 and the phosphorylation of Janus kinase 2 (JAK2) and signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) in the kidney were determined by Western blotting and immunohistochemical method.RESULTSIn model group, the severity of pathological changes increased over time by determining the proteinuria levels and observing the kidney pathological sections. However, the nephritis was improved on day 25. The expression level of SOCS3 did not change with the phosphorylation of JAK2/STAT3 immediately, but became increased when the disease was severer and got to a significantly higher level in convalescence.CONCLUSIONThe expression level of SOCS3 does not increase immediately after the remarkable phosphorylation of JAK2/STAT3, and the protective effect of SOCS3 in nephritis might occur in convalescence.

Suppressor of cytokine signaling; Nephrotoxic sera; Negative regulation; Signaling pathways

R364.5

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.07.025