鄧必高， 但 伶， 曹慧靈

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，重慶 400010)

1000-4718(2012)04-0746-05

2011-07-12

2011-10-24

△通訊作者 Tel: 023-63693472; E-mail: danling1@sohu.com

異丙酚對大鼠內(nèi)毒素腦損傷AIF表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響

鄧必高， 但 伶△， 曹慧靈

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，重慶 400010)

目的研究凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)和細(xì)胞凋亡在大鼠內(nèi)毒素(LPS)腦損傷中的變化情況，探討異丙酚在腦損傷中的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法SD大鼠72只，雌雄不限，體重220～250 g，隨機(jī)分為3組(n=24)：內(nèi)毒素組(LPS組)和內(nèi)毒素+異丙酚組(LPS+propofol組)經(jīng)左頸內(nèi)動脈注射LPS(1 mg/kg)建立大鼠內(nèi)毒素腦損傷模型，對照組(control組)經(jīng)頸內(nèi)動脈注射等量生理鹽水，LPS+propofol組頸內(nèi)動脈注射LPS后即予異丙酚100 mg/kg劑量腹腔注射。3組分別于6、12、24和48 h隨機(jī)處死6只大鼠，取額葉皮質(zhì)，檢測腦組織含水量，Annexin V-PI法檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡,免疫組織化學(xué)檢測AIF、NF-κB和caspase-3表達(dá)水平的變化，Western blotting測AIF表達(dá)的變化。結(jié)果與對照組相比，LPS組和LPS+propofol組各時(shí)點(diǎn)腦組織含水量增高，凋亡細(xì)胞增多，AIF、NF-κB和caspase-3表達(dá)增加(P<0.05,P<0.01)；與 LPS組比較, LPS+propofol組各時(shí)點(diǎn)腦含水量、凋亡細(xì)胞、AIF、NF-κB和caspase-3表達(dá)明顯減少 (P<0.05,P<0.01)。結(jié)論異丙酚減輕大鼠內(nèi)毒素性腦損傷的機(jī)制與抑制腦組織AIF表達(dá)水平及減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

異丙酚； 感染性腦損傷； 脂多糖類； 凋亡誘導(dǎo)因子； 細(xì)胞凋亡

內(nèi)毒素引起的腦損傷與多種炎癥因子大量釋放有關(guān)[1]，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的損傷和凋亡，引起彌漫性腦功能障礙，嚴(yán)重可發(fā)展為膿毒性腦病及多臟器功能障礙綜合征(multiple organ dysfanction syndrome，MODS)[2],是臨床重癥治療中的難點(diǎn)。大量研究表明，靜脈麻醉藥異丙酚(propofol)可影響多種細(xì)胞因子和炎癥反應(yīng)通路，具有抗自由基、抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的功能[3]，以及減輕炎癥反應(yīng)的作用[4]，有良好的免疫調(diào)節(jié)功能和潛在的神經(jīng)保護(hù)作用，但其對腦損傷時(shí)AIF是否產(chǎn)生影響尚未見相關(guān)報(bào)道，本研究采取建立大鼠內(nèi)毒素腦損傷模型，觀察異丙酚對內(nèi)毒素腦損傷后凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor,AIF)、NF-κB和caspase-3蛋白的表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響，進(jìn)一步探討異丙酚腦保護(hù)作用的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1藥物和試劑

脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)，批號為E.coli055∶B5，Sigma；異丙酚(批號為0912211 XLH 09，四川國瑞藥業(yè)有限責(zé)任公司)；AIF批號為BS2407)、NF-κB p65(批號為BS4135)和caspase-3(批號為BS1518)多克隆抗體(Bioworld)；SABC免疫組化染色試劑盒(批號為SA1020，武漢博士德生物工程有限公司)；RIPA裂解液(批號為P0013B，碧云天生物技術(shù)研究所)；HRP-羊抗兔IgG(批號為GAR-HRP，Pierce)；牛血清白蛋白 (批號為23209,Pierce)；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(批號為KGA106，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

2動物模型及分組

健康清潔級SD大鼠72只，雌雄不限，220～250 g，重慶醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。隨機(jī)分為3組：10%水合氯醛(350 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，行頸正中切口，分離左側(cè)頸總動脈、左頸內(nèi)動脈和左頸外動脈，結(jié)扎左頸外動脈，用微動脈鉗夾閉左頸總動脈近心端，行左頸總動脈遠(yuǎn)心端穿刺，LPS組、LPS+propofol組經(jīng)左頸內(nèi)動脈于15 s注射LPS 1 mg/kg(生理鹽水稀釋至0.2 mL)，對照組給予等容量生理鹽水，LPS+propofol組于頸內(nèi)動脈注射LPS后即予異丙酚100 mg/kg劑量腹腔注射，術(shù)畢止血縫合傷口。3組分別于6、12、24和48 h處死6只大鼠。

3標(biāo)本采集及處理

用10%的水合氯醛(350 mg·kg-1)對大鼠進(jìn)行麻醉后，快速斷頭取腦、冰上分離取出腦組織，經(jīng)視交叉垂直于額葉皮質(zhì)冠狀切取約3 mm厚腦組織塊置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋切片后用于HE染色、免疫組化檢測；同時(shí)迅速取額葉皮質(zhì)組織置于-80 ℃冰箱低溫保存，用于Western blotting檢測；其余腦組織用于含水量檢測及細(xì)胞凋亡檢測。

4腦組織含水量的測定

取新鮮腦組織，用濾紙蘸干表面血跡，電子天平稱濕重，置105 ℃烘箱中烘烤24 h后取出稱干重，按照Elliotl公式計(jì)算腦組織含水量=[(濕重-干重)/濕重]×100%。

5免疫組化染色觀察腦組織AIF、NF-κB和caspase-3的表達(dá)

取石蠟切片脫蠟、水化，嚴(yán)格按說明書步驟操作，鏡下觀察陽性表達(dá)為細(xì)胞漿或細(xì)胞核染色呈棕黃色。陰性對照以PBS代替Ⅰ抗。各組隨機(jī)取6張免疫組化染色切片，在顯微鏡下隨機(jī)采集5個(gè)高倍鏡(400倍)視野進(jìn)行照相，圖像資料使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測定每個(gè)視野陽性染色區(qū)域的吸光度值，求取每張切片的平均吸光度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

6Westernblotting檢測腦組織AIF的表達(dá)

從-80 ℃冰箱中取出腦組織，加入RIPA裂解液(強(qiáng))，冰上裂解勻漿30 min，4℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清，置于-80 ℃冰箱備用。BSA法測定總蛋白量。取蛋白樣量20 μg，加入SDS上樣緩沖液煮沸5 min，行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)3 h，室溫?fù)u床封閉1 h，加AIF多克隆抗體(1∶500)4 ℃搖床上封閉過夜，TBST洗膜5 min×3次，Ⅱ抗室溫封閉1 h，ECL化學(xué)發(fā)光、X光片記錄結(jié)果。內(nèi)參照為β-actin。膠片掃描、成像，用Quantity One 4.6.2軟件進(jìn)行蛋白條帶灰度分析。

7AnnexinV-PI染色法檢測細(xì)胞凋亡

取新鮮腦組織，于200目細(xì)胞篩輕輕研碎,PBS液沖洗，收集其單細(xì)胞懸液，嚴(yán)格按說明書操作，行流式細(xì)胞儀檢測，用CellQuest Pro軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1光鏡結(jié)果

腦組織HE染色可見對照組無明顯變化，LPS組和LPS+propofol組血管周圍間隙增寬，炎性細(xì)胞浸潤，部分神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)變形和空泡變性，可見核固縮及尼氏小體明顯縮小，且神經(jīng)元數(shù)量有所減少；LPS+propofol組損傷改變相對LPS組較輕，見圖1。

Figure 1. The results of HE staining (×400). A: control group; B: LPS group; C: LPS+propofol group.

圖1HE染色結(jié)果

2腦組織含水量

與對照組比較,LPS組和LPS+propofol組在各時(shí)點(diǎn)腦水腫程度明顯增高 (P<0.05)，其水腫在6 h達(dá)高峰,12 h仍維持在較高水平；與 LPS組比較, LPS+propofol組腦組織含水量明顯減少(P<0.05，P<0.01),見表1。

表1 各組腦組織含水量比較

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsLPS.

3免疫組化檢測AIF、NF-κB和caspase-3的表達(dá)

AIF、NF-κB和caspase-3陽性細(xì)胞在對照組幾無表達(dá)，LPS組在6 h開始有少量表達(dá)，陽性細(xì)胞呈棕黃色著色，主要位于胞漿，12 h表達(dá)逐漸增強(qiáng)，著色加深，24 h達(dá)高峰，胞漿、胞核中均見著色，48 h則呈下降趨勢；LPS+propofol組各時(shí)點(diǎn)較LPS組陽性細(xì)胞表達(dá)明顯減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，見圖2、3、4及表2。

Figure 2. AIF positive cells in cortex shown by immunohistochemical assay(×400).A:control group; B: LPS group; C: LPS+propofol group.

圖2免疫組化檢測AIF陽性細(xì)胞的表達(dá)

Figure 3. NF-κB positive cells in cortex shown by immunohistochemical assay(×400).A:control group; B: LPS group; C: LPS+propofol group.

圖3免疫組化檢測NF-κB陽性細(xì)胞的表達(dá)

Figure 4. Caspase-3 positive cells in cortex shown by immunohistochemical assay(×400).A: control group; B: LPS group; C: LPS+propofol group.

圖4免疫組化檢測caspase-3陽性細(xì)胞的表達(dá)

表2 各組AIF、NF-κB和Caspase-3平均吸光度值比較

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsLPS.

4Westernblotting檢測AIF的表達(dá)

AIF在對照組僅少量表達(dá)，LPS組從6 h開始蛋白表達(dá)帶逐漸增強(qiáng)，24 h達(dá)高峰，48 h仍處于較高水平，其趨勢與免疫組化一致；LPS+propofol組各時(shí)點(diǎn)較LPS組蛋白表達(dá)帶明顯減少，吸光度的分析比較顯示其具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

Figure 5. AIF protein expression in cortex detected by Western blotting.Lane 1: control group(6 h); Lane 2: LPS group(6 h);Lane 3: LPS+propofol group(6 h); Lane 4: LPS group(12 h);Lane 5: LPS+propofol group(12 h); Lane 6: LPS group(24 h);Lane 7: LPS+propofol group(24 h);Lane 8: LPS group(48 h); Lane 9: LPS+propofol group(48 h).*P<0.05vscontrol;##P<0.01vsLPS.

圖5腦皮層不同時(shí)點(diǎn)AIF蛋白表達(dá)

5AnnexinV-PI染色法檢測細(xì)胞凋亡

對照組細(xì)胞凋亡率較低，LPS組凋亡細(xì)胞從6 h開始增多，24 h達(dá)高峰，48 h仍處于較高水平；LPS+propofol組各時(shí)點(diǎn)較LPS組細(xì)胞凋亡率明顯減低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖6、表3。

討 論

參照王懷立等[5]的方法，本研究經(jīng)大鼠頸內(nèi)動脈注射LPS建立內(nèi)毒素腦損傷模型，結(jié)果表明，LPS組大鼠腦組織含水量較對照組各時(shí)點(diǎn)明顯增高，結(jié)合光鏡下觀察HE染色結(jié)果，提示腦細(xì)胞水腫和血腦屏障破壞，模型制備成功。

LPS是內(nèi)毒素的主要成分, 可促使CD14、腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)、Toll樣受體4(TLR4)、NF-κB、Fas等凋亡相關(guān)受體表達(dá)的增加，誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致多臟器損傷[6-7]。研究表明，細(xì)胞凋亡在腦損傷中有明確表現(xiàn)，并且其腦損傷程度和細(xì)胞凋亡有著直接的聯(lián)系[8]。研究表明，細(xì)胞凋亡存在著線粒體途徑(內(nèi)源性途徑)和細(xì)胞死亡受體途徑(外源性途徑)兩種相互關(guān)聯(lián)的途徑[9]，AIF在線粒體途徑起主導(dǎo)作用，而caspase-3和NF-κB等則在細(xì)胞表面死亡受體途徑中發(fā)揮重要作用。AIF介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是不依賴caspase 通路的細(xì)胞凋亡途徑, 并且AIF的促凋亡活性不受caspase抑制劑的抑制。Joza等[10]敲除小鼠胚胎干細(xì)胞的AIF基因后，發(fā)現(xiàn)其比野生鼠具有更強(qiáng)的凋亡耐受能力。Culm see等[11]研究發(fā)現(xiàn),AIF的下調(diào)可明顯減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡。同樣，減少caspase-3和NF-κB在損傷腦組織中的表達(dá)，也能起到抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡和減輕腦損傷的作用[12-13]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠內(nèi)毒素腦損傷后能夠使AIF激活，LPS組AIF、caspase-3和NF-κB的表達(dá)明顯增加，于6 h開始逐漸增高，24 h達(dá)到高峰，與凋亡細(xì)胞的動態(tài)變化一致，提示內(nèi)源性和外源性凋亡途徑均參與了內(nèi)毒素腦損傷后神經(jīng)元的凋亡過程。異丙酚是目前廣泛用于臨床的靜脈麻醉藥，研究表明異丙酚能夠有效地減輕細(xì)胞凋亡，具有保護(hù)作用。Yeh等[14]研究發(fā)現(xiàn),異丙酚能夠減輕LPS所導(dǎo)致的肺上皮細(xì)胞凋亡，Cattano等[15]研究發(fā)現(xiàn)使用低劑量的異丙酚能夠減輕幼鼠神經(jīng)元凋亡和損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，異丙酚處理后明顯減輕大鼠腦水腫和細(xì)胞凋亡，各時(shí)點(diǎn)AIF、NF-κB和caspase-3的表達(dá)水平也明顯下降，提示異丙酚可能同時(shí)通過阻斷內(nèi)源性和外源性兩條細(xì)胞凋亡途徑，減少AIF和caspase-3表達(dá)，在一定程度上減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮腦保護(hù)作用。

綜上所述，推測異丙酚減輕大鼠內(nèi)毒素腦損傷的機(jī)制可能與其抑制腦組織AIF表達(dá)水平，同時(shí)下調(diào)NF-κB和caspase-3的表達(dá)有關(guān)。對于異丙酚抗細(xì)胞凋亡機(jī)制進(jìn)行深入研究,可能會對異丙酚的臨床應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。

Figure 6. Apoptotic cells in cortex shown by Annexin V-PI staiming.

圖6AnnexinV-PI染色法檢測皮質(zhì)凋亡細(xì)胞

表3 各組腦組織細(xì)胞凋亡率的比較

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsLPS.

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EffectsofpropofolonexpressionofAIFandcellapoptosisinbraintissuesoftheratswithLPS-inducedbraininjury

DENG Bi-gao, DAN Ling, CAO Hui-ling

(DepartmentofAnesthesiology,SecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China.E-mail:danling1@sohu.com)

AIM: To investigate the effects of propofol on the expression of apoptosis-inducing factor (AIF) and cell apoptosis in brain tissues of rats with lipopolysaccharide(LPS)-induced brain injury.METHODSSeventy-two male and female SD rats weighing 220～250 g were randomly divided into 3 groups (n=24 each). Cerebral edema was induced by injection of LPS at 1 mg/kg via left internal carotid artery in LPS group and LPS+propofol group. In control group, equal volume of normal saline was administered instead of LPS. The rats in LPS+propofol group

intraperitoneal injection of propofol at 100 mg/kg immediately after LPS administration. Six rats in each group were decapitated 6 h, 12 h, 24 h or 48 h after operation and the frontal lobe cortex were immediately removed for determination of the water content. The apoptotic neurons were detected by Annexin V-PI staining. The protein levels of AIF, NF-κB and caspase-3 were measured by immunohistochemistry. The protein expression of AIF was detected by Western blotting analysis.RESULTSCompared with control group, the brain water content, the number of neuronal apoptosis and the protein expression levels of AIF, NF-κB and caspase-3 were significantly increased in LPS group and LPS+propofol group. Compared with LPS group, the results mentioned above were markedly reduced in LPS+propofol group.CONCLUSIONPropofol attenuates LPS-induced brain injury by decreasing AIF protein expression and inhibiting apoptosis.

Propofol; Infectious brain injury; Lipopolysaccharides; Apoptosis-inducing factor; Apoptosis

R641

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.031