岳智亮，馬惠斌，侯名語，潘延云

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001）

擬南芥At PLC4基因RNAi載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

岳智亮，馬惠斌，侯名語，潘延云

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001）

利用RNAi技術(shù)，構(gòu)建了AtPLC4基因的RNAi雙元載體，并進行了擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化，通過抗性篩選及PCR鑒定，獲得20株遺傳轉(zhuǎn)化株系．進一步通過RT－PCR檢測，得到3株AtPLC4基因表達降低的轉(zhuǎn)基因植株，為運用反向遺傳學(xué)的方法深入研究AtPLC基因家族的生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)．

擬南芥；AtPLC4；RNAi

肌醇磷脂依賴性磷脂酶C（phosphoinositidespecific phospholipase C，PI－PLC，簡稱為PLC）是肌醇磷脂信號系統(tǒng)中的關(guān)鍵組分之一．PLC受到外界刺激時可被受體激活，水解膜組分PIP2，產(chǎn)生雙信使分子IP3和DAG，調(diào)節(jié)細胞中Ca2＋的濃度和PKC的活性，影響一系列靶蛋白和靶酶的活性，參與多種生理過程［1－2］．1995年第1個植物PLC的cDNA在擬南芥中被克隆，隨后在煙草、百合等多個物種中也相繼被克?。?－6］．植物PLC基因的生物功能是多方面的，除對生長發(fā)育進行調(diào)節(jié)外［7－10］，還參與了眾多生物和非生物刺激的脅迫應(yīng)答反應(yīng)，如傷害［11］，厭氧［12］，病原侵染［13］，熱激［14］、乙烯、ABA等激素因子和冷、鹽、干旱等滲透脅迫因子［15－17］．但迄今對植物PLC基因的作用機制還遠未澄清．

植物PLC在許多物種中都含有多個亞型（isoform），不同的亞型可能分擔(dān)不同的生理功能．?dāng)M南芥基因組計劃完成后，檢索發(fā)現(xiàn)有9個AtPLC亞型［17］，基因芯片、實時定量PCR和GUS報告基因等方法研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同亞型不僅有各自的組織表達模式，而且在不同脅迫環(huán)境中被不同程度地誘導(dǎo)表達［17］．?dāng)M南芥作為一種模式植物已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于基因功能的研究，ABRC的建立使人們可以利用反向遺傳學(xué)的方法，直接從已知基因序列入手，通過功能缺失突變體的表型效應(yīng)，研究目的基因的功能．但ABRC中缺乏部分亞型如AtPLC4的T－DNA插入基因突變體．AtPLC4基因在多種脅迫環(huán)境中被不同程度地誘導(dǎo)表達，如在鹽、ABA、MS、冷和干旱脅迫環(huán)境下其表達量提高了1．5～6倍［17］．為了進一步研究AtPLC4在非生物脅迫中的作用，本研究利用RNAi技術(shù)，通過載體構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化獲得AtPLC4基因表達下調(diào)的轉(zhuǎn)基因植株，為深入研究AtPLC4的生物學(xué)功能和作用機制奠定基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1．1 實驗材料

擬南芥（Arabidopsisthaliana）Columbia生態(tài)型（Col）、RNAi載體p TCK303均為馬力耕教授惠贈；大腸桿菌菌株DH5α、農(nóng)桿菌菌株GV3101為本實驗室保存．

1．2 實驗方法

1．2．1 擬南芥的種植

擬南芥種子經(jīng)深層消毒（25 g／L次氯酸鈉，10 min，無菌水洗3～4次）后，4℃暗中春化3 d，播種在固體MS培養(yǎng)基（30 g／L蔗糖，8 g／L瓊脂粉，1×Murashige and Skoog鹽和維生素，p H用NaOH調(diào)至5．8）上，4℃暗中春化3 d，轉(zhuǎn)移到擬南芥培養(yǎng)室（22℃，16 h／8 h光暗周期，光照強度6 000～8 000 lx）中培養(yǎng)．10～14 d后（幼苗長出2～4片真葉），將幼苗移栽到浸透Hoagland營養(yǎng)液的蛭石中，相同溫度和光照條件繼續(xù)培養(yǎng)，適時適量向蛭石中加入Hoagland營養(yǎng)液．

1．2．2 RT－PCR及目的片段的擴增

選取擬南芥蓮座葉片，利用Trizol試劑提取總RNA，用Ta KaRa公司的AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA．提取及反轉(zhuǎn)錄方法按照試劑盒說明操作．以cDNA為模板，用引物5′－GAGCTCGGATCCAGGTCCATCAAAACATGGA－3′（下 劃 線 部 分 為 酶 切 位 點SacⅠ，BamHⅠ ）和5′－ACTAGTGTCGACTACTCTTTTGGAGGTTTTGTTG－3′（下劃線部分為酶切位點SpeⅠ，SalⅠ ）進行PCR，反應(yīng)體系為50μL，包括模板5．0μL，Buffer 5．0μL，d NTPs 4．0μL，引物分別為4．0μL，Taq聚合酶0．25μL，Pfu聚合酶0．25μL，H2O 27．5μL．?dāng)U增條件為：95℃預(yù)變性5 min；94℃ 變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min．PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測后，回收目的片段，回收產(chǎn)物分別與p MD19－T simple vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，進行藍白斑篩選，對陽性克隆進行質(zhì)粒提取及酶切驗證，對含有目的片段的質(zhì)粒進行測序，將測序正確的質(zhì)粒命名為P4X－T．

1．2．3 p TCK303－PLC4i載體構(gòu)建

擬南芥p TCK303－PLC4i載體構(gòu)建策略如圖1所示．以SacⅠ和SpeⅠ酶切將目的片段反向插入p TCK303質(zhì)粒，T4連接酶連接轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，獲得中間載體p TCK303 4－，鑒定無誤后再以SalⅠ和BamHⅠ酶切的目的片段正向插入該中間載體，再次進行T4連接酶的連接反應(yīng)和DH5α的轉(zhuǎn)化，獲得p TCK303－PLC4i載體．構(gòu)建好的載體經(jīng)酶切驗證后，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞，用于擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化．

圖1 pTCK303－PLC4i表達載體示意Fig．1 Construction of pTCK303－PLC4ivector

1．2．4 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的篩選

擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化采用浸花法［18］，收獲T0代種子后，播種于潮霉素（50 mg／L）的MS固體培養(yǎng)基上進行抗性篩選．選擇長出2片真葉并生根的幼苗，按照方法1．2．1繼續(xù)培養(yǎng)．p TCK303載體中既有潮霉素抗性篩選基因，也有GUS報告基因（圖1）．因此轉(zhuǎn)基因植株進一步通過GUS報告基因進行檢測，以獲取陽性株系．GUS染色液的配制及染色方法參考文獻［19］．

1．2．5 轉(zhuǎn)基因植株的RT－PCR分析

按照方法1．2．2獲得轉(zhuǎn)基因株系的cDNA，以此為模板，以野生型為對照檢測AtPLC4的轉(zhuǎn)錄水平的變化，引物分別為5′－GAGGGTGCGGTTATGTCAAG－3′和5′－AAGAGTGGAACAGCGCGTAT－3′．以Actin基因為內(nèi)參，引物為5′－GTTAGCAACTGGGATGATATGG－3′和5′－TCCACATCACACTTCATGAT－3′．PCR反應(yīng)體系：cDNA模板1．0μL，Buffer 1．0μL，d NTPs 0．8μL，上游引物0．8μL，下游引物0．8μL，Taq聚合酶0．1μL，H2O 5．5μL．PCR擴增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸50 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min．?dāng)U增產(chǎn)物用10 g／L的瓊脂糖凝膠檢測．

2 結(jié)果與分析

2．1AtPLC4目的片段的獲得

選擇AtPLC4 cDNA中一段不含SacⅠ，BamHⅠ，SpeⅠ和SalⅠ等酶切位點，長度約500 bp的序列，按照方法1．2．2進行PCR和瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得大小為478 bp的擴增條帶（圖2）．將該條帶進行回收，與p MD19－T simple vector連接．連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞．提取質(zhì)粒用BamHⅠ＋SalⅠ進行雙酶切驗證，結(jié)果如圖3示，顯示鑒定正確，測序結(jié)果顯示序列準確無誤，命名為P4X－T，可用于p TCK303－PLC4i雙元載體的構(gòu)建．

圖2AtPLC4基因目的片段的擴增Fig．2 PCR product of theAtPLC4

圖3 P4X－T載體的酶切驗證Fig．3 Identification of P4X－T vector by restriction digestionp

2．2 pTCK303－PLC4i雙元載體的構(gòu)建

根據(jù)p TCK303載體的酶切位點，按照方法1．2．3構(gòu)建p TCK303－PLC4i雙元表達載體．圖4顯示中間載體p TCK303 4－的酶切鑒定結(jié)果，用SacⅠ＋SpeⅠ切出466 bp的片段，顯示中間載體連接正確．圖5顯示最終載體p TCK303－PLC4i的酶切鑒定結(jié)果，泳道1為SacⅠ＋SpeⅠ雙酶切結(jié)果，泳道2為SalⅠ＋BamHⅠ雙酶切鑒定結(jié)果，均切出預(yù)計大小條帶；泳道3為用SacⅠ＋BamHⅠ對載體進行雙酶切，結(jié)果顯示酶切產(chǎn)物條帶大小與2條目的片段及Rice Intron長度總和一致，證明p TCK303－PLC4i載體構(gòu)建成功．

圖4 p TCK303 4－載體的酶切鑒定Fig．4 Identification of pTCK303 4－vector by restriction digestion

圖5 RNAi載體的酶切鑒定Fig．5 Identification of RNAi vector by restriction digestion

2．3 轉(zhuǎn)基因植株的抗性篩選及鑒定

將構(gòu)建好的p TCK303－PLC4i載體按照方法1．2．4轉(zhuǎn)化Col生態(tài)型擬南芥，成熟后收取T0代種子．然后將種子播種于MS（Hyg＋）培養(yǎng)基中進行篩選．由于載體帶有抗性基因，轉(zhuǎn)基因幼苗能夠在Hyg培養(yǎng)基中正常生長，10 d后能長出2片真葉并且正常生根，而未轉(zhuǎn)化的幼苗無法正常生長（圖6）．本文共獲得20株具有抗性的轉(zhuǎn)基因植株，隨機選取其中5株提取基因組DNA進行PCR鑒定，同時取葉片進行GUS染色鑒定．PCR的引物和參數(shù)同方法1．2．2，結(jié)果如圖7所示．野生型對照中，PCR可以擴出623 bp片段（含有內(nèi)元）（圖7泳道1），5株具有抗性的陽性苗中，均能擴出2條條帶，分別為623 bp和454 bp，說明轉(zhuǎn)基因植株中基因組中插入了目的序列（圖7泳道2～6）．

圖6 轉(zhuǎn)基因植株在平板上的生長情況Fig．6 Phenotype of positive transgenic plant on Petri dish

圖7 擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測Fig．7 PCR amplification of in transgenic plants

由于p TCK303－PLC4i載體中帶有GUS報告基因，轉(zhuǎn)基因植株可進行GUS染色分析，染色結(jié)果如圖8．轉(zhuǎn)基因陽性植株的葉片經(jīng)GUS染色后呈藍色，而野生型植株的葉片則不能被著色．以上結(jié)果表明p TCK303－PLC4i載體成功轉(zhuǎn)化擬南芥植株．

2．4 轉(zhuǎn)基因植株的RT－PCR檢測

選取上述3株經(jīng)PCR和GUS染色鑒定后的轉(zhuǎn)基因陽性植株，提取總RNA，檢測各株系A(chǔ)tPLC4基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果如圖9所示．3個轉(zhuǎn)基因株系與野生型相比，AtPLC4基因表達水平均降低，但沉默效率彼此不同，其中第1株沉默效率最佳．后續(xù)實驗將著重采用該株系進行．在上述3個株系中，本文還檢測了At－PLC家族中與AtPLC4同源性較高的另一個基因AtPLC8基因的表達，發(fā)現(xiàn)該基因表達量無明顯變化．表明p TCK303－PLC4i載體能夠特異性地引起AtPLC4基因表達下調(diào)．

圖8 轉(zhuǎn)基因植株GUS染色結(jié)果Fig．8 GUS staining of transgenic plants

圖9 轉(zhuǎn)基因植株的RT－PCR檢測Fig．9 Analysis of transgenic plants by RT－PCR

3 討論

本實驗中，RNAi載體構(gòu)建的策略是利用同一條擴增序列分別正向和反向連接到p TCK303載體上（圖1）．操作時，首先連接到載體上的是反向目的片段，這一步的順序問題是至關(guān)重要的．因為正向片段中包含SalⅠ，BamHⅠ位點，這2個酶切位點是用于連接反向片段的．如果先將正向片段與p TCK303載體進行連接，在連接反向目的片段時，用SalⅠ＋BamHⅠ對中間載體進行酶切回收，會同時將正向目的片段一同切除，而先連接反向片段，正向片段的酶切不會影響已經(jīng)連接到載體上的反向片段．按照這種策略，本課題組順利地構(gòu)建了RNAi載體p TCK303－PLC4i，使用不同的雙酶切組合對其進行鑒定，結(jié)果如圖5所示．泳道1為用SacⅠ＋SpeⅠ雙酶切載體p TCK303－PLC4i結(jié)果，切出與正向目的片段大?。?78 bp）一致的條帶；泳道2為SalⅠ＋BamHⅠ雙酶切鑒定結(jié)果，切出與反向目的片段大小（466 bp）一致的條帶；泳道3為用SacⅠ＋Bam HⅠ對載體進行雙酶切，結(jié)果顯示酶切產(chǎn)物條帶大小與2條目的片段及Rice Intron長度（496 bp）總和（1 440 bp）一致．雙酶切結(jié)果說明2個目的片段已經(jīng)以正確的方式連接到p TCK303載體上，可以用于擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化．

RNAi作為基因特異性敲除的有效方法，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動、植物基因功能研究．?dāng)M南芥基因組中的9個At PLCs基因亞型，不同亞型間可能存在著功能冗余，因此單個基因的突變不足以引起明顯的表型變化，這對利用反向遺傳學(xué)進行基因功能的研究帶來困擾，因此，本室擬利用雜交結(jié)合RNAi的方法獲得多個亞型的多基因突變體．本文采用RNAi的方法獲得了AtPLC4亞型的基因表達缺陷突變株，該突變體將進一步用于表型和生理分析及與其他亞型的突變體進行雜交，探索AtPLCs基因家族的生物學(xué)功能．

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（責(zé)任編輯：趙藏賞）

Construction and genetic transformation of RNAi vector for AtPLC4 gene of Arabidopsis

YUE Zhi－liang，MA Hui－bin，HOU Ming－yu，PAN Yan－yun
（College of Life Sciences，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001，China）

The RNAi vector forAtPLC4 gene was constructed and transformed intoArabidopsis．Twenty transgenic plants were identified by Hyg resistance screening and PCR．Three lines that lower expression ofAtPLC4 gene were identified by RT－PCR．Those transgenic plants will be used to study the functions of theAtPLCgene family by the reverse genetics method．

Arabidopsisthaliana；AtPLC4；RNAi

O658

A

1000－1565（2012）04－0393－06

2012－01－06

國家自然科學(xué)基金資助項目（30570993）；河北省自然科學(xué)基金資助項目（C2008000292）

岳智亮（1986－），男，山西平定人，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生．

潘延云（1963－），女，山東章丘人，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)教授，博士，主要從事植物分子生物學(xué)研究．E－mail：pyycell＠163．com