高一龍 溫 海 張匯東

干細(xì)胞治療技術(shù)在犬中的應(yīng)用進(jìn)展

高一龍 溫 海 張匯東

干細(xì)胞(Stem Cells)是一種未充分分化，尚不成熟的，具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞，在一定條件下它可以分化成多種功能細(xì)胞，是機(jī)體的起源細(xì)胞，是形成機(jī)體各個(gè)組織器官的“祖宗細(xì)胞”，具備再生各種組織器官的潛在功能，醫(yī)學(xué)界稱之為“萬用細(xì)胞”。根據(jù)干細(xì)胞所處的發(fā)育階段，可分為胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ES細(xì)胞)和成體干細(xì)胞(somatic stem cell)。目前，干細(xì)胞技術(shù)的研究主要集中于疾病治療、再生醫(yī)學(xué)和克隆等方向。

雖然大部分的干細(xì)胞研究都是針對(duì)人類醫(yī)療上的需求，但因?yàn)榘閭H動(dòng)物（犬）身體的構(gòu)造及疾?。ㄓ绕涫沁z傳病）與人類相似，所以常被當(dāng)成干細(xì)胞研究上的主要常用實(shí)驗(yàn)（模式）動(dòng)物，這也使得干細(xì)胞治療在小動(dòng)物臨床上有驚人的進(jìn)展。

干細(xì)胞治療脊髓 損傷

韓國(guó)建國(guó)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院教授金輝、研究員Jeong Uk-heon研究小組（2009）曾利用人類臍帶血間質(zhì)干細(xì)胞(hUCB-MSCs)成功治愈了脊髓受傷導(dǎo)致兩條后腿癱瘓的犬:對(duì)癱瘓的犬注入臍帶血干細(xì)胞，3周后開始出現(xiàn)恢復(fù)跡象，8周后四肢的運(yùn)動(dòng)能力恢復(fù)到正常水平，甚至還可以跳。據(jù)悉，研究小組已經(jīng)在國(guó)際學(xué)術(shù)雜志《脊髓神經(jīng)外科(Journal of Neurosurgery Spine)》上發(fā)表了這項(xiàng)研究結(jié)果。 此前，學(xué)界曾有過關(guān)于利用從人骨髓或脂肪提取的干細(xì)胞治療犬脊髓損傷的報(bào)告，但利用臍帶血干細(xì)胞成功治愈，這還是第一次。注入到犬體內(nèi)的干細(xì)胞不斷分化，制造出脊髓內(nèi)消失的神經(jīng)細(xì)胞，使脊髓損傷恢復(fù)到正常水平。

隨后，該研究小組對(duì)基于人臍帶血間質(zhì)干細(xì)胞(hUCB-MSCs)治療脊髓損傷(SCI) 的療法又進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)評(píng)估和驗(yàn)證，并觀察了該療法對(duì)脊髓損傷犬的長(zhǎng)期影響。他們采用了10頭脊髓受傷的犬作為研究對(duì)象，7頭在脊髓損傷一星期后移植hUCB-MSCs，而剩下的3頭犬沒有移植。其中2頭移植hUCB-MSCs的犬，一個(gè)月后死亡，死于移植后造成的泌尿道感染、褥瘡和敗血癥；3頭沒有移植hUCB-MSCs 的SCI犬從3個(gè)月到1年這段觀察期間其運(yùn)動(dòng)和感覺功能并沒有改善，且他們的泌尿功能障礙一直持續(xù)到被實(shí)施安樂死；而另外5頭移植hUCB-MSCs的犬中有4頭犬后腿功能得到顯著恢復(fù)，這4頭犬的運(yùn)動(dòng)和感覺功能在移植后3年逐漸恢復(fù)。研究結(jié)果表明，移植人臍帶血間質(zhì)干細(xì)胞治療脊髓損傷犬有積極的治療效果，組織學(xué)檢查顯示，人臍帶血間質(zhì)干細(xì)胞能夠顯著提高脊髓損傷犬的髓鞘再生能力。

另外，印度獸醫(yī)泰米爾納德邦和動(dòng)物科學(xué)學(xué)院也曾應(yīng)用自體干細(xì)胞療法，對(duì)一頭3歲脊髓損傷的犬開展這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，幫助犬從脊髓損傷中恢復(fù)（2009）。

干細(xì)胞治療進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥

進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良（progressive muscular dystrophy， PMD）是一組X染色體連鎖隱性遺傳病，患者的肌肉細(xì)胞會(huì)呈進(jìn)行性的退化萎縮直至死亡。其中最典型也最嚴(yán)重的叫杜氏（Duchenne）進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良，此病是由于患者肌肉細(xì)胞中抗肌萎縮蛋白基因的突變?cè)斐?，使得患者癱瘓或過早的死亡。

犬的進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥狀與患PMD的人類極其類似，意大利米蘭San Raffaele研究院的Giulio Cossu研究團(tuán)隊(duì)于2006年在《自然》雜志發(fā)表了一項(xiàng)研究報(bào)告：他們應(yīng)用干細(xì)胞技術(shù)對(duì)罹患肌肉萎縮癥(肌營(yíng)養(yǎng)不良癥)的黃金獵犬進(jìn)行治療，已取得重大實(shí)驗(yàn)成效，患病犬頭肌力顯著增強(qiáng)，可以像健康犬一樣跑跳。該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)成果可能預(yù)示著對(duì)治療人類危害極大的杜氏進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良（漸凍癥）具有積極意義。

Cossu教授領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)首先從健康犬的肌肉血管中取出mesoangioblast干細(xì)胞，在實(shí)驗(yàn)室中將其擴(kuò)增培養(yǎng)到足夠數(shù)量，然后在5個(gè)月時(shí)間里分批次陸續(xù)將數(shù)千萬個(gè)mesoangioblast干細(xì)胞注射到罹患杜顯氏肌肉萎縮癥的犬血管內(nèi)；這些犬的免疫系統(tǒng)在實(shí)驗(yàn)前已受到抑制以免產(chǎn)生排斥?；加羞M(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良的黃金獵犬通常在8個(gè)月大時(shí)，行走就會(huì)產(chǎn)生困難，而這些經(jīng)過干細(xì)胞治療的患犬行走能力要強(qiáng)得多，有一頭經(jīng)過干細(xì)胞治療的黃金獵犬甚至在13個(gè)月大時(shí)，還能行走。

研究者對(duì)經(jīng)干細(xì)胞治療的患病實(shí)驗(yàn)犬肌肉組織進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)這些mesoangioblast干細(xì)胞通過血液轉(zhuǎn)移，然后從毛細(xì)血管慢慢擴(kuò)散到實(shí)驗(yàn)犬全身的肌肉組織中，這些mesoangioblast干細(xì)胞與肌肉組織中原先存在的肌肉纖維融合，產(chǎn)生了肌肉細(xì)胞中原先不存在的抗肌萎縮蛋白，并使得原先的肌肉纖維更新。但是，如果用來自正常供體犬的干細(xì)胞進(jìn)行移植這種方法來治療杜氏進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良的患者，效果并不完美，因?yàn)檫@樣被治療的患犬，需要終身服用抗排異藥物來防止發(fā)生排異反應(yīng)。

所以，這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的下一步是嘗試修正患病犬的自體細(xì)胞，以使這些犬無需繼續(xù)施打抗排斥藥物。Cossu研究團(tuán)隊(duì)試圖尋找到解決這一問題的方法，他們從患有進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良的實(shí)驗(yàn)犬的血管中采集mesoangioblast干細(xì)胞，因?yàn)?，這些實(shí)驗(yàn)犬的mesoangioblast干細(xì)胞同樣缺失抗肌萎縮蛋白基因，所以研究者用慢病毒載體將外源的抗肌萎縮蛋白插入患病實(shí)驗(yàn)犬的mesoangioblast干細(xì)胞的細(xì)胞核，然后再將這些經(jīng)過修復(fù)的mesoangioblast干細(xì)胞回注到實(shí)驗(yàn)犬的體內(nèi)。這些被移植了經(jīng)過修復(fù)后的自體mesoangioblast干細(xì)胞的患病犬的肌肉細(xì)胞中產(chǎn)生了抗肌萎縮蛋白，但是它們的癥狀沒有得到改善。Cossu分析可能是因?yàn)橛昧私囟痰目辜∥s蛋白，所以沒有能改善這些實(shí)驗(yàn)犬的癥狀?？辜∥s蛋白基因是人類基因組中最大的一個(gè)基因，長(zhǎng)度達(dá)到250萬個(gè)堿基對(duì)，無法載入較安全的相關(guān)病毒載體，這是目前全世界的科學(xué)家用基因治療的方法治療杜氏進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良的遇到的首要難題。若要解決這一問題，可能需要用不同版本的抗肌萎縮蛋白，插入這些患病犬的mesoangioblast干細(xì)胞。

長(zhǎng)期來看，如果這種自體干細(xì)胞移植療法行得通，患者就可以不用終身服用免疫抑制劑。而目前如果不服用免疫抑制劑，這些受試犬在接受健康犬的干細(xì)胞后，將會(huì)很快再次喪失行走能力。Cossu教授已計(jì)劃進(jìn)行臨床試驗(yàn)，初步做法將采用已在患病犬身上獲得成效的方法，亦即使用從捐贈(zèng)者身上取得的干細(xì)胞。他預(yù)測(cè)若要讓肌肉萎縮的病患移植經(jīng)基因修正的自體干細(xì)胞，還得需要幾年時(shí)間。

干細(xì)胞治療骨關(guān)節(jié)損傷

賽馬和賽犬等競(jìng)技動(dòng)物，因?yàn)榻?jīng)常比賽會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的骨關(guān)節(jié)損傷，這也使得獸醫(yī)在外科手術(shù)的同時(shí)，積極尋求應(yīng)用干細(xì)胞技術(shù)方法非損傷性治療骨關(guān)節(jié)疾病的方法。鑒于間質(zhì)干細(xì)胞能夠分化成骨、軟骨、肌腱和韌帶的組成細(xì)胞（以及肌肉，脂肪，可能還有其它組織），有科學(xué)家試圖研究利用成年來源的間質(zhì)干細(xì)胞，來治療動(dòng)物骨頭、軟骨、韌帶、及肌腱上的這些組織的損傷或缺損疾病。間質(zhì)干細(xì)胞主要來源于脂肪組織或骨髓，由于異體間質(zhì)干細(xì)胞的接種可能會(huì)造成排斥，所以間質(zhì)干細(xì)胞通常是采取自體移植的方式。但在一些研究犬及馬的骨折修復(fù)手術(shù)中，所采用的間質(zhì)干細(xì)胞并沒有誘發(fā)免疫排斥反應(yīng)，相反的此類問質(zhì)干細(xì)胞可以促進(jìn)骨折處的骨組織再生。已有相關(guān)的文獻(xiàn)證實(shí)，可以利用脂肪組織或骨髓來源的干細(xì)胞來治療肌腱和韌帶受傷的馬匹。

干細(xì)胞技術(shù)克隆犬

韓國(guó)干細(xì)胞治療技術(shù)研究公司RNL Bio 2009年1月29日稱，該公司和首爾國(guó)立大學(xué)合作以取自犬脂肪組織的干細(xì)胞成功克隆了兩頭黑色小犬，這是全球首例使用干細(xì)胞技術(shù)克隆犬。此前，英國(guó)、日本、美國(guó)和新西蘭的科學(xué)家都曾成功用干細(xì)胞克隆出綿羊、豬、老鼠和鹿。2005年，首爾國(guó)立大學(xué)成功利用普通皮膚細(xì)胞制造了全球第一頭克隆犬“首努比”（阿富汗獵犬）。應(yīng)用干細(xì)胞技術(shù)成功克隆犬類動(dòng)物這還是第一次，首爾國(guó)立大學(xué)克隆項(xiàng)目的負(fù)責(zé)人李秉川認(rèn)為在基因研究領(lǐng)域，干細(xì)胞比普通細(xì)胞更有優(yōu)勢(shì)。

RNL Bio公司的負(fù)責(zé)人羅鄭贊稱，公司計(jì)劃對(duì)干細(xì)胞克隆技術(shù)進(jìn)行商業(yè)推廣。應(yīng)用該技術(shù)，寵物犬的主人就可以事先儲(chǔ)存犬的干細(xì)胞，等到愛犬生病時(shí)可以使用干細(xì)胞給犬治病，甚至在犬去世后，還可以利用干細(xì)胞克隆一模一樣的犬。

結(jié) 語

干細(xì)胞治療技術(shù)作為一種新型的疾病治療手段，它克服了臨床常規(guī)治療的局限性，為動(dòng)物和人類疾病的治療打開了全新的思路，展示出廣闊的應(yīng)用前景，干細(xì)胞治療技術(shù)在組織工程領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用?？梢灶A(yù)想，在不遠(yuǎn)的將來，開展干細(xì)胞的研究，定向培養(yǎng)與生產(chǎn)犬的各種組織器官，可以為因執(zhí)行任務(wù)受槍傷、刀傷或生病的警犬，進(jìn)行器官移植，對(duì)保持和恢復(fù)警犬的戰(zhàn)斗力大有益處。

但是干細(xì)胞治療是目前最復(fù)雜的生物療法，有許多的技術(shù)難點(diǎn)尚未突破，其確切的療效和安全性有待驗(yàn)證，尚不能在臨床上廣泛應(yīng)用。干細(xì)胞治療技術(shù)的操作標(biāo)準(zhǔn)、產(chǎn)品質(zhì)量控制等問題也需進(jìn)一步規(guī)范。

（作者單位：公安部南京警犬研究所，210012）

（編輯：李 冰）