高允允,王秋艷,黃黎鋒,李海峰

(杭州師范大學(xué)生物醫(yī)藥與健康研究中心，浙江 杭州 311121)

萜類(lèi)微生物生物合成研究進(jìn)展

高允允,王秋艷,黃黎鋒,李海峰

(杭州師范大學(xué)生物醫(yī)藥與健康研究中心，浙江 杭州 311121)

萜類(lèi)是一類(lèi)具有重要研究及藥用價(jià)值的天然化合物.近年來(lái)，隨著萜類(lèi)合成途徑中各種關(guān)鍵酶基因克隆、異源表達(dá)和功能鑒定，許多萜類(lèi)生物合成途徑逐漸清晰.以萜類(lèi)微生物生物合成過(guò)程中的中間產(chǎn)物為線(xiàn)索，綜述了應(yīng)用代謝工程、合成生物學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)等技術(shù)開(kāi)展的萜類(lèi)微生物生物合成的研究進(jìn)展.

萜類(lèi)；微生物；生物合成

萜類(lèi)化合物是廣泛存在于植物、微生物、昆蟲(chóng)中的一類(lèi)具有豐富種類(lèi)多樣性和復(fù)雜結(jié)構(gòu)多樣性的天然化合物，在天然藥物、高級(jí)香料、食品添加劑、殺蟲(chóng)劑、除草劑等方面都具有廣泛應(yīng)用[1-3]，對(duì)人類(lèi)的健康、生產(chǎn)和生活具有重要價(jià)值.但是萜類(lèi)作為次生代謝產(chǎn)物，在天然原料中的含量極低，直接提取純化難度大、成本高，不利于其規(guī)?；a(chǎn)和廣泛應(yīng)用.隨著萜類(lèi)合成研究的不斷進(jìn)展，多種萜類(lèi)的生物合成途徑得以解析.利用分子生物學(xué)技術(shù)將萜類(lèi)合成途徑中的多個(gè)酶基因克隆后導(dǎo)入微生物重組表達(dá)，重組酶在細(xì)胞內(nèi)重新組建合成途徑，利用微生物的基礎(chǔ)代謝分子為起始物完成萜類(lèi)的合成，稱(chēng)為萜類(lèi)的微生物生物合成.微生物生長(zhǎng)速度快、發(fā)酵成本低等的優(yōu)勢(shì)將極大降低萜類(lèi)生產(chǎn)成本；并且與植物相比遺傳背景更清晰的微生物易于進(jìn)行遺傳改造，為通過(guò)代謝工程和合成生物學(xué)技術(shù)大幅提高萜類(lèi)產(chǎn)量以及發(fā)掘新結(jié)構(gòu)、新活性的萜類(lèi)衍生物提供了便利.萜類(lèi)微生物生物合成研究開(kāi)發(fā)了明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的天然提取分離的生產(chǎn)技術(shù)的新的萜類(lèi)生產(chǎn)技術(shù)，為未來(lái)萜類(lèi)的工業(yè)化生物合成生產(chǎn)奠定基礎(chǔ).

本文將以研究較多的紫杉醇和青蒿素兩種高價(jià)值萜類(lèi)化合物為主要闡述對(duì)象，對(duì)微生物生物合成萜類(lèi)化合物的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述總結(jié).

1 紫杉醇

紫杉醇(taxol)又稱(chēng)紅豆杉醇，最早從太平洋紅豆杉Taxusbrevifolia的樹(shù)皮中分離得到的一類(lèi)具有顯著抗癌活性的二萜類(lèi)化合物，紫杉醇類(lèi)藥物已經(jīng)被廣泛用于臨床治療.紫杉醇的生物合成途徑如圖1所示.由紫杉烯合酶(taxadiene synthase)催化香葉基香葉基二磷酸(GGPP)環(huán)化生成的紫杉烯(taxadiene)是具有紫杉烷母核結(jié)構(gòu)的第一個(gè)重要中間體，該化合物再經(jīng)一系列氧化、羥化反應(yīng)生成紫杉醇.

圖1 紫杉醇生物合成途徑Fig.1 The biosynthetic pathway of taxol

1.1大腸桿菌中紫杉烯生物合成研究

大腸桿菌有自身的脫氧木酮糖-5-磷酸途徑(DXP)，可以提供紫杉烯合成需要的異戊烯焦磷酸(IPP)前體，但是大腸桿菌缺乏自身的GGPP合成酶，無(wú)法進(jìn)一步提供合成所需的GGPP.因此在大腸桿菌中合成紫杉烯，不僅需要導(dǎo)入紫杉烯合成酶還要導(dǎo)入外源的GGPP合成酶.Huang等[4]將IPP異構(gòu)酶、GGPP合酶和紫杉烯合酶3個(gè)基因?qū)氪竽c桿菌進(jìn)行共表達(dá)，獲得了1.3 mg/L培養(yǎng)物紫杉烯.Ajikumar等[5]將紫杉烯的生物合成途徑分成負(fù)責(zé)供應(yīng)IPP前體的上游DXP途徑模塊，和負(fù)責(zé)紫杉烯合成的下游GGPP合酶和紫杉烯合酶模塊，通過(guò)多變量模塊優(yōu)化的方法對(duì)2個(gè)合成模塊的進(jìn)行參數(shù)變量?jī)?yōu)化，例如啟動(dòng)子強(qiáng)度和質(zhì)?？截悢?shù)等，探索出使這2個(gè)合成途徑達(dá)到最佳平衡狀態(tài)的培養(yǎng)條件，從而提高了紫杉烯的產(chǎn)量，使之達(dá)到了大約1 g/L發(fā)酵液(相當(dāng)于初始產(chǎn)量的15 000倍).

雖然大腸桿菌具有培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)周期短、適合高密度發(fā)酵等優(yōu)點(diǎn)，適宜用來(lái)生物合成紫杉烯，但是大腸桿菌幾乎無(wú)法活性表達(dá)植物來(lái)源的P450酶，因此不適合用來(lái)合成紫杉烯下游產(chǎn)物.

1.2 釀酒酵母中紫杉醇生物合成

相對(duì)于大腸桿菌缺少GGPP合成途徑，釀酒酵母自身具有類(lèi)異戊二烯/固醇代謝途徑，該途徑合成的GGPP可用于生物合成紫杉醇中間體紫杉烯.由紫杉烯到紫杉醇需要多個(gè)II型P450氧化酶參與，相對(duì)于大腸桿菌的簡(jiǎn)單細(xì)胞結(jié)構(gòu)，釀酒酵母具有完整的細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)，可以確保與紫杉醇生物合成相關(guān)的羥化酶基因的活性表達(dá).因此，釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)非常適合于紫杉烯及其下游中間體的生物合成研究.

雖然釀酒酵母自身具有GGPP合成途徑，但是其代謝流僅能滿(mǎn)足自身所需的甾醇和麥角固醇等萜類(lèi)的合成需要，為了合成大量紫杉烯及其下游產(chǎn)物，需要通過(guò)外源表達(dá)增加合成途徑的限速步驟的催化酶(例如羥甲基戊二酰CoA還原酶，HMGR)的表達(dá)量，從而提高IPP和GGPP供應(yīng)量.甾醇和麥角固醇合成需要消耗IPP和GGPP前體，對(duì)于紫杉烯的合成具有很強(qiáng)的前體競(jìng)爭(zhēng)抑制作用.因此減少前體競(jìng)爭(zhēng)性抑制是提高釀酒酵母合成紫杉烯的產(chǎn)量的關(guān)鍵.Engels等[6]將修飾過(guò)的HMGR的基因，導(dǎo)入含有紫杉烯合成酶，并且敲除了甾醇和麥角固醇合成酶的釀酒酵母工程菌中，紫杉烯產(chǎn)量提高了50%；而導(dǎo)入密碼子優(yōu)化過(guò)的硫化葉菌(Sulfolobusacidocaldarius)的GGPP合酶基因使得紫杉烯的產(chǎn)量提高了40倍，高達(dá)8.7±0.85 mg/L，但同時(shí)副產(chǎn)物GGPPOH(攏牛兒基攏牛兒基醇)的產(chǎn)量為33.1 mg/L.這些結(jié)果雖然消除了部分前體競(jìng)爭(zhēng)抑制，但是說(shuō)明增加的GGPP代謝流仍然有很大部分并沒(méi)有用來(lái)合成目的產(chǎn)物，具體原因尚不明朗，但同時(shí)也暗示代謝流如果都能用來(lái)合成紫杉烯，其產(chǎn)量可以進(jìn)一步提高.

P450酶在紫杉醇生物合成中起著關(guān)鍵的作用.紫杉醇生物合成途徑中大約一半的酶催化反應(yīng)是在P450單加氧酶的催化下完成的.由紫杉烯到紫杉醇分子的合成途徑尚不完全清晰，但已知至少有10多步酶催化反應(yīng)，大部分為P450酶參與的氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生的中間體分子多達(dá)上百種.雖然紫杉醇只是其中幾種中間體的終產(chǎn)物，但催化反應(yīng)之間的相互作用，中間體之間的相互競(jìng)爭(zhēng)作用對(duì)紫杉醇的合成具有重要作用.因此研究紫杉醇合成途徑中的P450酶對(duì)于闡明紫杉醇合成途徑和實(shí)現(xiàn)終產(chǎn)物紫杉醇的微生物生物合成具有重要意義.Jennewein等[7]從紅豆杉的cDNA文庫(kù)中克隆的一個(gè)紫杉烯5α-羥基化酶(Cytochrome P450 taxadiene5α-hydroxylase)，在釀酒酵母中進(jìn)行了重組表達(dá),能夠有效地催化taxa-4(5),11(12)-diene和taxa-4(20),11(12)-diene生成taxa-4(20),11(12)-dien-5α-ol.Kaspera等[8]發(fā)現(xiàn)了6種新的紫杉烯的CYP450單加氧酶，這6種酶的基因序列具有高度同源性(>70%)，和其他植物的同源性卻很低.盡管這些酶具有如此高的同源性，酶功能分析顯示在生物合成途徑的早期，就具有顯著的底物特異性.DeJong等[9]分別克隆了紫杉烯生物合成途徑中的GGPP合酶，紫杉烯合酶，以及紫杉烯5α、10β、13α-羥化酶(Cytochrome P450 taxoid 5α，10β，13α-hydroxylases)，紫杉烯-5α-ol-O-乙?；D(zhuǎn)移酶,紫杉烯10β-羥化酶的8個(gè)基因，并將這8個(gè)基因在釀酒酵母中分別進(jìn)行了重組表達(dá).他們將3個(gè)基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶基因同時(shí)導(dǎo)入酵母，并在酵母中檢測(cè)到了微量的(25 μg/L)紫杉烯的一種下游氧化產(chǎn)物taxadien-5α-ol，說(shuō)明在酵母中導(dǎo)入多個(gè)基因合成紫杉烯的下游產(chǎn)物甚至是紫杉醇從技術(shù)上是完全可行的.

從GGPP形成紫杉醇只有約19步酶催化反應(yīng)，而紫杉醇類(lèi)似物卻有好幾百種.Kaspera等[8]證明除了以紫杉烯為中間產(chǎn)物的主干合成途徑，一定存在其他旁路，形成紫杉?jí)A、taxinines、taxayunnanines以及其他最終代謝產(chǎn)物.因此這些紫杉烷單加氧酶和基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶的底物選擇性，在紫杉醇的合成轉(zhuǎn)化中起著最關(guān)鍵的作用.Croteau[10]認(rèn)為由于對(duì)紫杉醇合成酶基因進(jìn)行功能鑒定的過(guò)程中使用的底物一般都是替代底物，而生物合成途徑中真正的底物是什么卻不十分清楚，反應(yīng)步驟的先后順序也不是很明確，這給紫杉醇生物合成的研究帶來(lái)了難度，也是后續(xù)研究需要突破的問(wèn)題.

1.3 內(nèi)生真菌生物合成紫杉醇

某些植物中分離出來(lái)的內(nèi)生真菌具有與宿主植物產(chǎn)生相同天然產(chǎn)物的能力.Stierle等[11]從太平洋紅豆杉樹(shù)皮中分離出一個(gè)內(nèi)生真菌，命名為T(mén)axomycesandreanae，它具有穩(wěn)定產(chǎn)生紫杉醇的能力，產(chǎn)量約為24～50 ng/L.隨后很多實(shí)驗(yàn)室相繼分離出一系列產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌.不過(guò)目前分離出的內(nèi)生真菌紫杉醇產(chǎn)量都不高，還達(dá)不到工業(yè)化的要求.但是真菌的遺傳操作比植物更簡(jiǎn)單，篩選高產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌，通過(guò)克隆內(nèi)生真菌中紫杉醇合成途徑相關(guān)基因，建立內(nèi)生真菌的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，并將紫杉醇合成途徑關(guān)鍵酶基因構(gòu)建到真菌表達(dá)載體上，利用基因工程手段提高內(nèi)生真菌中紫杉醇含量，是目前解決藥源問(wèn)題的有效途徑之一.

通過(guò)上述描述我們知道微生物生物合成紫杉醇的研究目前主要集中在紫杉烯的產(chǎn)量提高上，這也是最接近工業(yè)化生產(chǎn)的研究前沿.雖然工程菌直接生物合成紫杉醇目前還不可行，但是合成中間產(chǎn)物紫杉烯的產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到工業(yè)標(biāo)準(zhǔn).紫杉烯經(jīng)過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化后可以制得多種紫杉醇衍生物，具有不亞于紫杉醇的抗癌效果，同時(shí)能夠克服病灶對(duì)紫杉醇的耐藥性.

2 青蒿素

圖2 青蒿素的半生物合成路線(xiàn)Fig2 The semi-biosynthetic pathway of artemisinin

青蒿素是我國(guó)科學(xué)工作者20世紀(jì)70年代初首次從黃花蒿中分離并鑒定出的抗瘧有效單體，具有高效低毒的抗瘧特性，被世界衛(wèi)生組織稱(chēng)為目前世界上唯一有效的瘧疾治療藥物.青蒿素目前主要從黃花蒿葉片、花蕾中提取，是一種環(huán)氧化的倍半萜內(nèi)酯，其現(xiàn)有的半生物合成路線(xiàn)如圖2所示.它的生成由乙酰CoA經(jīng)甲羥戊酸(mevalonic acid, MVA)途徑合成FPP，經(jīng)紫穗槐-4,11-二烯合酶(ADS)催化生成紫穗槐-4,11-二烯，在紫穗槐-4,11-二烯P450羥基化酶(CYP71AV1)催化下生成青蒿酸，再經(jīng)過(guò)其他催化反應(yīng)最后生成青蒿素.其中紫穗槐-4,11-二烯和青蒿酸是關(guān)鍵性前體(中間體).

雖然目前用工程菌生產(chǎn)青蒿素前體取得了重大的進(jìn)展，但還只能生產(chǎn)前體紫穗槐二烯和青蒿酸.因?yàn)榍噍锼岬角噍锼氐拿复呋襟E及其相關(guān)酶還未完全闡明，至今還沒(méi)有實(shí)現(xiàn)用微生物直接合成青蒿，但化學(xué)轉(zhuǎn)化青蒿酸到青蒿素僅需要2步簡(jiǎn)單的反應(yīng)，已具備工業(yè)生產(chǎn)可行性.因此實(shí)現(xiàn)青蒿素的生物合成實(shí)際上僅需要實(shí)現(xiàn)青蒿酸的生物合成.

2.1 大腸桿菌生產(chǎn)紫穗槐二烯

法尼基焦磷酸(Farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP)是在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的合成輔酶Q和細(xì)胞壁必不可少的物質(zhì)；同時(shí)它又是青蒿素合成的基本單體之一，這為利用大腸桿菌生產(chǎn)青蒿素提供了必需的物質(zhì)基礎(chǔ).紫穗槐二烯合成酶催化FPP合成紫穗槐二烯(Amorpha-4,11-diene)，是青蒿素合成的重要中間體.Martin等[12-13]將來(lái)自黃花蒿的紫穗槐二烯合成酶基因(ADS)導(dǎo)入大腸桿菌，檢測(cè)到了微量目的產(chǎn)物紫穗槐-4,11-二烯；將大腸桿菌中再導(dǎo)入甲羥戊酸(MVA)途徑合成酶，目的產(chǎn)物產(chǎn)量達(dá)到24 mg/L.雖然產(chǎn)量較低，但這是首次成功利用工程菌生物合成重要天然藥物，意味著有可能應(yīng)用微生物更加有效地大量生產(chǎn)其他市售的天然產(chǎn)物類(lèi)昂貴藥物.Newman等[14]利用Martin構(gòu)建的大腸桿菌紫穗槐-4,11-二烯工程菌，使用分區(qū)生物反應(yīng)器培養(yǎng)大腸桿菌，通過(guò)兩相培養(yǎng)法提取揮發(fā)性萜類(lèi)化合物.獲得了產(chǎn)量高達(dá)0.5 g/L的紫穗槐-4,11-二烯，說(shuō)明通過(guò)對(duì)工程菌相關(guān)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，是完全有可能將目的產(chǎn)物的產(chǎn)量提高到工業(yè)化水平.萜類(lèi)合成的產(chǎn)量除了與前體供應(yīng)量和發(fā)酵條件有關(guān)系外，還與合成途徑中各部分代謝能力的平衡有重要的關(guān)系.導(dǎo)入的MVA途徑中的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶(HMGS)和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)的代謝活性是上述合成途徑中的限速環(huán)節(jié)，因此Tsuruta[15]在前者研究基礎(chǔ)上，從金黃色葡萄球菌中克隆HMGS和HMGR基因，導(dǎo)入大腸桿菌中，取代了前者研究中使用的來(lái)自于釀酒酵母的相應(yīng)酶.這兩個(gè)酶能夠很好地與已有合成途徑的其他催化酶協(xié)同作用，實(shí)現(xiàn)高通量的代謝流的平衡.接下來(lái)通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)條件中碳和氮的濃度優(yōu)化，產(chǎn)生的紫穗槐-4,11-二烯的濃度高達(dá)27.4 g/L.這是已報(bào)道的青蒿素前體的最高產(chǎn)量，也是微生物合成萜類(lèi)化合物的已知最高產(chǎn)量.如此之高的產(chǎn)量使得生物合成青蒿素呈現(xiàn)很好的產(chǎn)業(yè)化前景，同時(shí)也充分證明了大腸桿菌在合成萜類(lèi)化合物上具有巨大的潛力，完全具備工業(yè)化生產(chǎn)的能力.

從青蒿素的前體紫穗槐-4,11-二烯，還需要P450酶的幾步氧化反應(yīng)才能生成青蒿素.Teoh等[16]從黃花蒿腺毛的cDNA文庫(kù)中分離得到一個(gè)P450氧化酶基因CYP71AV1.實(shí)驗(yàn)證明，CYP71AV1是一個(gè)多功能的酶，可以氧化紫穗槐-4,11-二烯生成青蒿醛，再轉(zhuǎn)化為青蒿酸.但是在大腸桿菌中表達(dá)植物來(lái)源的P450酶一直是公認(rèn)的難題之一.相對(duì)于植物來(lái)源的P450酶難于原核活性表達(dá)和需要NADPH的FMN/FAD還原酶配合使用，巨大芽孢桿菌的P450BM3酶因其本身即為氧化酶和還原酶的融合蛋白，且易于原核活性表達(dá)，而具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì).Dietrich等[17]將巨大芽孢桿菌的P450BM3突變體在產(chǎn)物紫穗槐二烯的大腸桿菌表達(dá)，在胞內(nèi)將產(chǎn)物紫穗槐二烯選擇性氧化，得到了250mg/L的arteminsinic-11s,12-epoxide.該產(chǎn)物可通過(guò)簡(jiǎn)單的化學(xué)反應(yīng)合成二氫青蒿酸，最后合成青蒿素.該方法路線(xiàn)不僅比之前使用CYP71AV1所得到的氧化產(chǎn)物青蒿酸合成青蒿素路線(xiàn)的產(chǎn)量更高，P450BM3合成途徑的培養(yǎng)時(shí)間減少2～7 d，而且不需要將副產(chǎn)物末端烯烴分離出來(lái).

2.2 釀酒酵母工程菌生產(chǎn)青蒿素

釀酒酵母自身存在MVA途徑，能夠生產(chǎn)大量的胞內(nèi)IPP和FPP用于自身甾醇的合成，釀酒酵母遺傳操作技術(shù)已經(jīng)非常成熟，而且在釀酒酵母中不存在對(duì)于大部分萜類(lèi)化合物對(duì)大腸桿菌的毒害作用，因此釀酒酵母是萜類(lèi)合成的適宜宿主菌.Ro等[18]以釀酒酵母為宿主菌，導(dǎo)入克隆的ADS基因，然后通過(guò)外源重組載體導(dǎo)入MVA途徑相關(guān)酶基因，增加酶的拷貝數(shù)從而增加了酶的表達(dá)量，增加IPP和FPP的供應(yīng)量，產(chǎn)物紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量達(dá)到了153 mg/L；在導(dǎo)入CYP71AV1基因，誘導(dǎo)表達(dá)得到115 mg/L的青蒿酸，再通過(guò)更簡(jiǎn)單的化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)化為青蒿素.

目前，大腸桿菌合成紫穗槐二烯的產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到27.4 g/L發(fā)酵液，而釀酒酵母合成青蒿酸的產(chǎn)量也達(dá)到115 mg/L發(fā)酵液的水平.兩個(gè)前體都可以通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化獲得終產(chǎn)物青蒿素.兩者的研究成果表明青蒿素的半生物合成技術(shù)路線(xiàn)已經(jīng)基本滿(mǎn)足了大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)需要，有理由相信生物合成的青蒿素產(chǎn)品將最終取代天然提取的青蒿素產(chǎn)品，成為市場(chǎng)的主流.

3 其他萜類(lèi)化合物的微生物生物合成

微生物生物合成萜類(lèi)化合物在其他萜類(lèi)化合物中的研究也受到了學(xué)者的廣泛關(guān)注.Yoon等[19]將構(gòu)建的pT-DHB重組子和pSSN12Didi一起導(dǎo)入大腸桿菌，使β-胡蘿卜素的產(chǎn)量提高到49.3 mg/g細(xì)胞干重，把微生物合成類(lèi)胡蘿卜素的產(chǎn)量提高到一個(gè)新的水平.Albermann[20]crtI重組質(zhì)粒的過(guò)表達(dá)，crtE和crtB單拷貝表達(dá)，顯著提高了四脫氫番茄紅素產(chǎn)量，高達(dá)253 μg/g細(xì)胞干重.Miao等[21]構(gòu)建了一個(gè)名為MK19的突變體紅法夫酵母，優(yōu)化培養(yǎng)條件后，得到最高25.8 mg/L的蝦青素的產(chǎn)量.Leonard E等[22]通過(guò)外源基因?qū)爰皩?duì)下游途徑中的限制步驟進(jìn)行改造，構(gòu)建的GGPP合酶和LPS的重組突變體合成左旋海松二烯產(chǎn)量大約提高了2 600倍，最大產(chǎn)量約700 mg/L.

4 結(jié) 語(yǔ)

萜類(lèi)化合物作為一大類(lèi)具有各種生物活性的天然產(chǎn)物，在醫(yī)藥、食品工業(yè)具有重要應(yīng)用價(jià)值.大部分萜類(lèi)物質(zhì)的天然提取方式都存在含量低、難分離的問(wèn)題，同時(shí)自然資源匱乏的現(xiàn)實(shí)也促使科學(xué)家尋找新的生產(chǎn)方式.大腸桿菌、鏈霉菌等工程菌合成抗生素、氨基酸等天然產(chǎn)物的研究給微生物合成萜類(lèi)物質(zhì)提供了借鑒.大腸桿菌體系具有遺傳背景清晰、遺傳操作體系成熟、發(fā)酵周期短、生產(chǎn)成本低、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，非常適合作為萜類(lèi)合成的宿主系統(tǒng).而事實(shí)也證明，對(duì)于不含氧原子的萜烯類(lèi)的生物合成，大腸桿菌系統(tǒng)是最佳選擇.但是大腸桿菌系統(tǒng)很難功能性表達(dá)植物來(lái)源的P450酶等萜類(lèi)合成后期修飾酶，因此對(duì)于結(jié)構(gòu)復(fù)雜的含氧萜類(lèi)來(lái)說(shuō)，合成的產(chǎn)物基本為萜類(lèi)上游中間體，例如青蒿素和紫杉醇合成.相對(duì)于大腸桿菌來(lái)說(shuō)，釀酒酵母不僅能夠合成萜類(lèi)上游中間體，其完整的內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)還能夠很好地活性表達(dá)植物來(lái)源的P450氧化酶，在胞內(nèi)對(duì)上游中間體進(jìn)行氧化反應(yīng)，得到結(jié)構(gòu)上更接近于終產(chǎn)物的下游中間體，為其化學(xué)轉(zhuǎn)化為相關(guān)活性衍生物和終產(chǎn)物提供便利.盡管目前大腸桿菌仍然是用來(lái)合成萜類(lèi)的最多選擇，而且大腸桿菌的生長(zhǎng)量和生物轉(zhuǎn)化量要明顯超過(guò)釀酒酵母；但是隨著許多萜類(lèi)的合成途徑中P450酶催化反應(yīng)機(jī)理的逐步闡明，釀酒酵母將會(huì)是含氧原子的萜醇類(lèi)合成的最佳選擇.除了上述兩種微生物外，鏈霉菌、芽孢桿菌、假單胞菌、畢赤酵母在合成萜類(lèi)天然產(chǎn)物方面均有過(guò)報(bào)道，雖然具有各自相應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，但是由于遺傳背景不清、操作技術(shù)落后、產(chǎn)量低等缺點(diǎn)，距離實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)還是有相當(dāng)遠(yuǎn)的距離.

微生物合成萜類(lèi)是生物合成研究的新領(lǐng)域，它是分子生物學(xué)、代謝工程、系統(tǒng)生物學(xué)和微生物學(xué)融合交叉后產(chǎn)生的新學(xué)科——合成生物學(xué)的代表性研究?jī)?nèi)容，也是合成生物學(xué)最接近生產(chǎn)實(shí)踐的前沿研究.合成生物學(xué)的最終目的是實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，而微生物合成萜類(lèi)必將成為其工業(yè)化生產(chǎn)的成功典范，為人類(lèi)的健康事業(yè)貢獻(xiàn)力量.

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AdvanceinTerpenoidMicrobialBiosynthesis

GAO Yun-yun， WANG Qiu-yan， HUANG Li-feng， LI Hai-feng

(Center for Biomedicine and Health，Hangzhou Normal University， Hangzhou 311121， China)

Terpenoid is a class of natural compounds with research and medicinal value. In recent years, the researches on terpenoid microbial biosynthesis have made great progress. Using the intermediates in the biosynthesis as clues, this paper summarized the research advance of terpenoid microbial biosynthesis by using the technology of metabolic engineering, synthetic biology and systematic biology.

terpenoids; microorganism; biosynthesis

2012-02-15

李海峰(1980—)，男，助理研究員，博士，主要從事微生物生物合成天然藥物研究.E-mail:lihaifengwater@163.com

11.3969/j.issn.1674-232X.2012.04.017

Q812

A

1674-232X(2012)04-0374-06