周 俊，潘麗軍，韓智宏

（合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點實驗室，安徽合肥230009）

高純菜籽蛋白的制備及其相關(guān)性質(zhì)研究

周 俊，潘麗軍，韓智宏

（合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點實驗室，安徽合肥230009）

對脫毒后的冷榨菜籽粕進行蛋白提取，超濾純化提取液獲得高純度的蛋白成品，并研究分析了蛋白的成分、氨基酸及其功能特性。脫毒后菜籽粕中蛋白提取率為67.97%，超濾后蛋白純度可達70%～90%。成品蛋白中植酸與硫苷未檢出，多酚含量隨蛋白純度增加而顯著下降，甲硫氨酸+半胱氨酸是第一限制性氨基酸，其余必需氨基酸化學(xué)評分均高于FAO/WHO標準，卻大多低于全蛋蛋白標準。菜籽蛋白的持水性、吸油性、乳化性及乳化穩(wěn)定性、起泡性及起泡穩(wěn)定性均與蛋白純度呈正相關(guān)。

高純菜籽蛋白，制備，性質(zhì)

菜籽是全世界產(chǎn)量第二的油料作物，據(jù)美國農(nóng)業(yè)部（USDA）2010年8月預(yù)計，10～11年全球油菜籽產(chǎn)量將達5674萬t，由此將產(chǎn)生3306萬t的菜籽餅粕，其中國內(nèi)占892.8萬t[1]。餅粕中的蛋白是一種優(yōu)質(zhì)植物蛋白，含量約35%～45%，其氨基酸組成模式良好，符合FAO推薦需求[2]。菜籽蛋白水解得到的生物活性多肽具有降血壓[3]以及作為HIV抑制因子的功效[4]；在各種食物配方中，不同菜籽蛋白產(chǎn)品也表現(xiàn)出令人滿意的功能特性[5－6]。20世紀八十年代，加拿大開發(fā)的氨水甲醇/正己烷雙液相萃取技術(shù)從菜籽中成功分離出油脂和脫毒菜籽粕[7－8]，之后Tzeng等人在此基礎(chǔ)上又建立了以膜分離技術(shù)為核心的菜籽蛋白制備法，包括堿提、等電點沉淀、超濾、滲濾、干燥五個關(guān)鍵步驟，可獲得純度＞90%的兩類菜籽蛋白，產(chǎn)品低植酸（＜1%），無硫苷（＜2μmol/g）[9]。與此同時，國內(nèi)也展開對菜籽餅粕制取分離蛋白及濃縮飼用蛋白的應(yīng)用研究，這些研究工作的開展為菜籽餅粕的資源利用奠定了一定基礎(chǔ)[10]。不過目前中國在菜籽蛋白的開發(fā)應(yīng)用方面仍以實驗室研究居多，產(chǎn)業(yè)化方面的實施較少，至今大部分仍作為飼料或肥料利用。這是由于傳統(tǒng)菜籽制油采用的高溫預(yù)榨工藝造成蛋白質(zhì)變性，以及餅粕中硫苷、植酸、單寧等抗營養(yǎng)物質(zhì)的存在，很難生產(chǎn)出質(zhì)量較好的蛋白產(chǎn)品，因此嚴重制約了菜籽蛋白的商品化應(yīng)用。本文在脫毒冷榨菜籽粕基礎(chǔ)上，采用超濾精制法制備高純菜籽蛋白，并分析了菜籽蛋白的成分、氨基酸及功能特性，為進一步深度開發(fā)利用菜籽蛋白提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

冷榨雙低菜籽粕粉 安徽大平油脂有限公司，粉碎后過60目篩，水分9.91%，脂肪3.44%，植酸2.47%，蛋白38.63%；大豆分離蛋白 北京奧博星生物技術(shù)有限公司，食品級，蛋白純度≥90%；冰乙酸、氫氧化鈉、氯化鈉、石油醚、濃硫酸、濃硝酸、偏釩酸銨、鉬酸銨、磷酸二氫鉀、氯化鈀、無水碳酸鈉、福林酚試劑、沒食子酸、羧甲基纖維素鈉、甲基紅、溴甲酚綠等 均為分析純。

SQ2119B型多功能食品加工機 上海帥佳電子科技有限公司；TH2-82A型恒溫振蕩器 金壇市杰瑞爾電器有限公司；RP1-G型冷熱缸 溫州飛翔食品機械廠；GL-20G-Ⅱ型離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；SS300型三足式離心機、GQ75B高速管式分離機 上海浦東天本離心機械有限公司；DGZ20/4-1型真空干燥箱 南京實驗儀器廠；膜分離設(shè)備 合肥風(fēng)云膜分離技術(shù)有限公司；KM100型卷式超濾膜 美國KOCH公司；LPG-5型噴霧干燥機 常州市振興干燥設(shè)備廠；S4300氨基酸分析儀 德國SKYNM公司；DS-1型組織搗碎機 上海越磁電子科技有限公司。

1.2 檢測方法

1.2.1 理化指標測定 蛋白測定：凱氏定氮法，參照GB/T 9823—2008；水分測定：常壓干燥法，參照GB/ T5009.3—2003；脂肪測定：索式提取法，參照GB/ T5009.6—2003；灰分測定：碳化灼燒法，參照GB/ T5009.4—2003；粗纖維測定：介質(zhì)過濾法，參照GB/ T5009.10—2003；多酚測定：Folin-Ciocalteu試劑比色法，參照ISO14502-1—2005；植酸測定：磷鉬黃比色法[11]；硫苷測定：氯化鈀快速比色法[12]。

1.2.2 氨基酸分析及化學(xué)評分 稱取20mg蛋白試樣于氨基酸水解管中，加10.00mL 6mol/L HCl，用酒精噴燈封管，置于110℃烘箱中水解22h。取出冷卻，打開水解管，50℃真空干燥后，加樣品稀釋液10.00mL，溶液過0.45μm膜，于2mL進樣瓶中供氨基酸分析儀測定用。

化學(xué)評分CS[13]參照FAO/WHO成人氨基酸需求標準（1991）[13]和全蛋蛋白標準（1984）[13]，按下式計算：

1.2.3 功能性檢測

1.2.3.1 持水性WA測定[14]稱取3g樣品于離心管中，記錄下管和樣品的總質(zhì)量m1，再加入25mL去離子水，持續(xù)攪拌，之后3000r/min下離心10min，離心后得到的沉淀在50℃下保持25min，稱量管和樣品總質(zhì)量m2，則WA（%）=（m2-m1）/3×100%

1.2.3.2 吸油性FA測定[14]準確稱取1g樣品于離心管中，加入12mL大豆色拉油m1，放置30min后，3000r/min離心10min，稱量上層大豆色拉油的重量m2，則FA（%）=（m1-m2）×100%

1.2.3.3 乳化性EC及乳化穩(wěn)定性ES的測定 參照Dipak K.Dev的方法[15]，并加以改動。稱取0.1g樣品2份，分別分散于裝有25mL蒸餾水的試管中，再加入2.5mL大豆色拉油?？焖僬袷?min，將兩管中液體取出倒入帶刻度離心管中。1000r/min離心3min，取出離心管，觀察乳化情況，記下乳化層高度H1及管中液體高度H2，則EC（%）=H1/H2×100%

將上述離心管置于80℃水浴中，加熱30min后，用自來水冷卻至室溫。再次1000r/min離心3min，取出離心管，記下乳化層高度H3及管中液體高度H4，則ES（%）=H3/H4×100%

1.2.3.4 起泡性FC及起泡穩(wěn)定性FS的測定[14]配制3%的蛋白質(zhì)溶液，在DS-1高速組織搗碎機中，以1000r/min的轉(zhuǎn)速攪拌1min，測量泡沫體積V，則

之后每隔5min測定泡沫體積V1，則FS（%）=V1/V× 100%

1.3 蛋白制備

稱取過60目篩的菜籽粕粉10kg，將其倒入已盛好脫毒劑的冷熱缸中脫毒，脫毒條件在前期實驗中已確立為：醋酸質(zhì)量分數(shù)0.7%，提取溫度48℃，液料比10∶1（v/w），提取時間1.6h。待脫毒結(jié)束，先后用三足式離心機和高速管式分離機離心料液，收集餅粕殘余物于40℃真空干燥備用。將干燥好的脫毒菜籽粕進行粉碎，準確稱取10g（精確到0.0001g）于250mL三角瓶中，按一定料液比加入蛋白提取劑，混勻后置于恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速設(shè)為200r/min，室溫狀態(tài)下按一定時間和一定次數(shù)浸提菜籽蛋白。浸提液用GL-20G-Ⅱ型離心機離心，離心速度設(shè)為6000r/min，時間10min，所得上清液即為菜籽蛋白提取液。蛋白提取率Y1及蛋白得率Y2分別按式（1）和式（2）計算：

式中：m表示10kg菜籽粕脫毒后殘余粕中總蛋白質(zhì)量（kg）；Y1表示脫毒菜籽粕中的蛋白提取率；Y2表示從未脫毒菜籽粕中所能提取到的蛋白量。

按照優(yōu)選出的蛋白提取條件，將脫毒菜籽粕倒入已盛好蛋白提取劑的冷熱缸中進行蛋白提取。所得蛋白提取液先后用三足式離心機和高速管式分離機離心，離心出的液體即為菜籽蛋白提取液。再稱量30kg的蛋白提取液用截留分子量（NMWCO）=50ku的膜超濾，超濾條件：進料壓力0.5～0.7MPa，超濾溫度40℃。膜分離結(jié)束后，收集截留液，進行噴霧干燥，干燥條件：進風(fēng)溫度180～200℃，空氣風(fēng)壓0.4～0.6MPa。干燥成品即為高純菜籽蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜籽蛋白提取

根據(jù)1.3的要求，對脫毒菜籽粕進行蛋白提取。菜籽蛋白提取率及得率見表1。

由表1可看出，菜籽蛋白在40g/L NaOH提取條件下，提取率最高，但從NaOH 4g/L時，提取劑與菜籽粕接觸瞬間，就會導(dǎo)致提取液顏色加深，隨著NaOH濃度越來越高，顏色越來越深，這明顯不符合所期望的蛋白顏色。此外據(jù)報道，用堿液處理蛋白類物料會生成可能對人體有毒性的賴丙氨酸（lysinoalanine）。Deng等人詳細證明了嚴格控制蛋白提取條件的必要性，堿提菜籽蛋白不推薦在長時間、高pH（＞12）下接觸進行[6]。鹽提雖然所得菜籽蛋白色澤較好，但提取率低，且NaCl使用量大大超過NaOH，而后續(xù)菜籽蛋白膜分離純化中，超濾若不完全會導(dǎo)致一部分鹽殘留在蛋白中，造成蛋白純度下降。綜合上述考慮，菜籽蛋白提取條件選為：1g/L NaOH，液料比（V/W）10∶1，溫度28℃，提取時間20min，提取次數(shù)3次。三次提取過程料液pH分別為：5.97～6.13，7.31～7.54，9.02～9.34，均小于12。

表1 不同條件對菜籽蛋白提取的影響Table 1 Effect of different conditions on extraction of rapeseed protein

經(jīng)測定，10kg菜籽粕脫毒后，脫毒液中含有848.26g蛋白，而菜籽粕（未提植酸）蛋白含量為38.63%（據(jù)表1計算而得），則10kg未脫毒菜籽粕含有3863g蛋白，扣除脫毒損失的848.26g，剩余粕中還有3014.74g蛋白。再根據(jù)式（2），則得到蛋白得率Y2的數(shù)據(jù)，見表1。文中NaOH濃度用g/L代替pH，并采用先配提取劑法，即將配好的提取劑加入到菜籽粕中，均考慮到實際生產(chǎn)中，pH無論是先調(diào)還是后調(diào)都比較繁瑣，特別在pH較高時，pH計反應(yīng)遲鈍，容易影響溶液pH的準確性。因此NaOH濃度用g/L表示，預(yù)先調(diào)好來提取菜籽蛋白。

2.2 超濾精制菜籽蛋白

表2 加水量對菜籽蛋白純度的影響Table 2 Effect of water feed on purity of rapeseed protein

按照2.1中選定的蛋白提取條件進行菜籽蛋白放大提取，稱取30kg菜籽蛋白提取液進行超濾純化，通過對超濾過程中加水量的控制，再噴霧干燥截留液，可獲得不同純度的菜籽蛋白產(chǎn)品，加水量對成品菜籽蛋白純度影響如表2所示。

由表2可看出，加水量增加可顯著提高菜籽蛋白的純度。這是因為菜籽蛋白的提取液含有淀粉、多糖、脂類、醋酸、無機離子等多種非蛋白雜質(zhì)成分，超濾過程中，由于膜元件上凝膠濾餅層的形成會阻擋一部分非蛋白成分的透過[16]；同時超濾過程中每次截留液濃縮到10～12L時，需要加水才能使超濾繼續(xù)進行，否則無法超濾，必然導(dǎo)致一部分非蛋白成分還殘存在截留液中，影響蛋白純度的提高。加水增加了料液體積，使得截留液超濾可以繼續(xù)進行。同時料液的稀釋減少了濃差極化的形成[17]，使得非蛋白成分可以更多地透過，從而提升蛋白純度。但過多的加水量也不經(jīng)濟，會給后續(xù)濃縮、干燥造成負擔(dān)。

2.3 脫毒前后菜籽粕和不同純度菜籽蛋白的成分分析

由于菜籽粕中含有較多抗營養(yǎng)因子，很大程度上制約了菜籽粕的利用。本研究對脫毒前后菜籽粕和不同純度的菜籽蛋白進行相關(guān)成分分析，見表3。逐一比較每種成分的變化趨勢，為相關(guān)應(yīng)用提供依據(jù)。

表3 脫毒前后菜籽粕和不同純度菜籽蛋白的成分分析Table 3 Chemical components analysis of rapeseed meal with pre－and past detoxication and different rapeseed protein on purity

表3反映出不同純度菜籽蛋白中的抗營養(yǎng)因子含量，相比脫毒前后的菜籽粕均大大減少。特別是植酸和硫苷均未檢測出，但多酚依然存在，這也說明多酚很難通過醋酸脫毒和超濾的方法完全去除掉。本文所得到的菜籽蛋白在色澤上明顯淺于一般傳統(tǒng)堿溶酸沉法制備的蛋白，但與商用大豆分離蛋白還有差距。這是因為菜籽蛋白中多酚的存在，會加深其色澤[18]。

2.4 菜籽蛋白氨基酸分析

以制備的90.49%菜籽蛋白為對象，對其進行氨基酸組成及含量分析，結(jié)果見表4。

食物蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值的高低，主要取決于所含必需氨基酸的種類、數(shù)量和組成比例?；瘜W(xué)評分是目前國際上廣泛采用的對蛋白質(zhì)進行營養(yǎng)價值評價的方法，即對待測樣品與標準中的必需氨基酸含量進行比較，比值大于1說明該氨基酸含量高于標準值，是理想狀況。從表4分析結(jié)果可看出，除色氨酸未檢測外，其余七種必需氨基酸均存在。參照兩種標準，菜籽蛋白中的甲硫氨酸+半胱氨酸均是第一限制性氨基酸。其余必需氨基酸含量（色氨酸除外）整體均高于FAO/WHO推薦的成人需求標準，卻大多低于全蛋蛋白標準。在FAO/WHO標準中，菜籽蛋白的賴氨酸含量充足，而谷物類食品卻較低，但谷物類食品富含甲硫氨酸+半胱氨酸[19]，所以可通過二者的配比，達到平衡的氨基酸模式。在全蛋蛋白標準中，雖然菜籽蛋白中一些必需氨基酸含量不足，但可作為魚的飼料級蛋白，Z.Teskered?ic＇等人曾將幼年虹鱒魚飼料中39%的蛋白改為由菜籽濃縮蛋白來提供，對魚的攝食、生長沒有任何負面影響[20]。結(jié)合表3所示的抗營養(yǎng)因子檢測結(jié)果，總體評價，菜籽蛋白是一種很具潛力的蛋白補充劑。

表4 菜籽蛋白的氨基酸組成及化學(xué)評分CSTable 4 Amino acid composition of rapeseed protein and its chemical score

2.5 菜籽蛋白的功能特性

2.5.1 持水性和吸油性 圖1反映出隨著蛋白純度的提高，菜籽蛋白的持水能力和吸油能力均緩慢增強，但持水能力與商用大豆分離蛋白還有一定差距；而商用大豆分離蛋白的吸油性與81.36%菜籽蛋白相當，表明菜籽蛋白具有良好的吸油性。蛋白質(zhì)持水性是指蛋白質(zhì)吸收并將水保留在蛋白質(zhì)組織中的能力，蛋白質(zhì)的吸油性是指蛋白質(zhì)與游離脂肪相結(jié)合的能力。蛋白的持水性與食品貯藏過程中的“保鮮”及“保型”有密切關(guān)系[21]，在食品加工過程中，它會影響食品的機械強度、黏性、塑性以及流動性，并可維持食品中的水分，延長食品的保鮮期。蛋白質(zhì)良好的吸油性可改善食品的適口性和風(fēng)味。吸油性和持水性是蛋白質(zhì)應(yīng)用于肉類食品生產(chǎn)中的一個重要功能特性，是產(chǎn)品生產(chǎn)加工中的重要質(zhì)量控制指標。提高蛋白質(zhì)的持水性和吸油性可有效改善肉類產(chǎn)品的硬度、粘度和口感等。

圖1 蛋白持水性和吸油性的比較Fig.1 Comparison of water-holding capacity and fat-absorbing capacity

2.5.2 乳化性及乳化穩(wěn)定性 由圖2可見，乳化性及乳化穩(wěn)定性均隨蛋白純度提高而上升，90.49%菜籽蛋白乳化性優(yōu)于商用大豆分離蛋白，但商用大豆分離蛋白乳化穩(wěn)定性最好。蛋白質(zhì)的乳化特性在于組成蛋白質(zhì)的氨基酸既有疏水性氨基酸又有親水性氨基酸，因此決定了蛋白質(zhì)分子同時含有親油性和親水性基團，是天然的表面活性劑，在油水混合液中可以擴散到油水界面形成油水乳化液[22]。乳狀液的形成可給予食品良好的口感，有助于包合油溶性和水溶性的配料，許多食品如牛乳、蛋黃醬、冰激凌、湯料等都是乳狀液。

圖2 蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的比較Fig.2 Comparison of emulsion capacity and emulsion stability

圖3 蛋白起泡性比較Fig.3 Comparison of foaming capacity

2.5.3 起泡性及起泡穩(wěn)定性 從圖3和圖4可看出，無論起泡性或氣泡穩(wěn)定性，不同純度的菜籽蛋白總體上都較優(yōu)于商用大豆分離蛋白，菜籽蛋白隨純度的升高，起泡性不斷提高，泡沫穩(wěn)定性也明顯改善。蛋白質(zhì)的水溶液受到機械攪拌時會有大量氣體混入而形成大量的水－空氣界面，由于極性和非極性基團的存在，表現(xiàn)出較強的表面活性而吸附到水－空氣界面上，形成蛋白質(zhì)膜，從而降低表面張力，促進泡沫的形成，同時部分肽鍵在界面上伸展開來，通過分子內(nèi)和分子間的相互作用力，形成二維保護網(wǎng)絡(luò)，維持泡沫的穩(wěn)定。利用蛋白質(zhì)的發(fā)泡性，可以賦予食品疏松的結(jié)構(gòu)和良好的口感，許多加工食品都是泡沫型產(chǎn)品，如奶油、蛋糕、啤酒、果汁軟糖等。

圖4 蛋白起泡穩(wěn)定性的比較Fig.4 Comparison of foaming stability

3 結(jié)論

3.1 脫毒菜籽粕中的蛋白提取條件為：1g/L NaOH，液料比（V/W）=10∶1，溫度28℃，提取時間20min，提取次數(shù)3次，此時蛋白提取率為67.97%，相當于能從未脫毒菜籽粕中提取到20.49%的蛋白（占菜籽粕重）。在此條件下得到的蛋白提取液通過控制超濾純化過程中的加水量，可獲得70%～90%不同純度的菜籽蛋白。

3.2 不同純度菜籽蛋白中均未檢出植酸與硫苷，多酚含量隨蛋白純度增加而顯著減少。氨基酸分析表明：除色氨酸未檢測外，其余七種必需氨基酸均存在。甲硫氨酸+半胱氨酸是菜籽蛋白中的第一限制性氨基酸，其余必需氨基酸化學(xué)評分均高于FAO/WHO標準，卻大多低于全蛋蛋白標準。

3.3 菜籽蛋白的持水性、吸油性、乳化性及乳化穩(wěn)定性、起泡性及泡沫穩(wěn)定性均與蛋白純度呈正相關(guān)，90.49%蛋白的各項功能特性最好。與商用大豆分離蛋白相比，菜籽蛋白持水性、乳化性及乳化穩(wěn)定性還有差距，吸油性整體差別不大，而起泡性與泡沫穩(wěn)定性則明顯優(yōu)越。

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Study on preparation of high-purity rapeseed protein and its properties

ZHOU Jun，PAN Li-jun，HAN Zhi-hong
（School of Biotechnology and Food Engineering，The Key Laboratory for Agricultural Products Processing of Anhui Province，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China）

Protein was extracted from coldpressed rapeseed meal which was detoxicated firstly，then the extract was ultrafiltered to obtain high-purity rapeseed protein，chemical components，amino acid and function of proteins were also studied.Extraction rate of protein from rapeseed meal after detoxication was 67.97%，rapeseed protein of different purity from 70%to 90%could be prepared by ultrafiltration.Phytic acid，glucosinolate were not detected in proteins，and content of polyphenol was decreased obviously with rise of protein purity.Sulphur-containing amino acid（Methionine+Cysteine）was the first limiting amino acid.Chemical scores of the other essential amino acids were higher than FAO/WHO standard，but most were inferior to standard of whole egg protein.Capacities of water-holding，fat-absorbing，emulsion，emulsion stability，foaming and foam stability correlated positively with purity of rapeseed protein.

high-purity rapeseed protein；preparation；property

TS201.2+1

B

1002－0306（2012）03－0189－05

2011－04－08

周俊（1986－），男，碩士研究生，研究方向：食品現(xiàn)代加工理論、方法及工程化技術(shù)。

國家“863”計劃項目（2010AA101503）；“十一五”國家科技支撐計劃項目（2006BAD05A12）。