董愛文，朱深海，王國慶

（1.吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南張家界427000；2.吉首大學(xué)城鄉(xiāng)資源與規(guī)劃學(xué)院，湖南張家界427000）

野生粉葉爬山虎種子等部位的原花青素提取純化工藝及含量測定

董愛文1，朱深海2，王國慶1

（1.吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南張家界427000；2.吉首大學(xué)城鄉(xiāng)資源與規(guī)劃學(xué)院，湖南張家界427000）

通過正交實(shí)驗(yàn)研究粉葉爬山虎中原花青素提取條件。結(jié)果表明：提取時(shí)間100min，乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，提取溫度65℃，料液比1∶10為較佳條件。香草醛-鹽酸法測得果梗、果皮、種子中含量分別為2.6317%、3.7967%、4.0934%；大孔吸附樹脂分離純化的結(jié)果表明：LSA-21樹脂適合分離純化粉葉爬山虎中原花青素，分離條件：上樣液質(zhì)量濃度為20mg/mL，洗脫流速為2.0BV/h，經(jīng)HPLC測得純化后果梗、果皮與種子中原花青素含量為2.39%、2.31%、3.94%；HPLC檢測LSA-21樹脂分離純化后的原花青素純度可達(dá)87%以上。

粉葉爬山虎，原花青素，提取分離，HPLC

粉葉爬山虎（Parthenocissus thomsonili planch）為葡萄科爬山虎屬多年生落葉木質(zhì)藤本植物，其根、莖可入藥，具有破淤血、消腫毒、清涼利尿的功效[1]；成熟果實(shí)為紫黑色球形漿果，爬山虎屬植物是原花青素的一種潛在資源植物[2]。原花青素（proanthocyanidins，簡稱PC）是植物中廣泛存在的一大類由兒茶素、表兒茶素等聚合而成的多酚類化合物的總稱[3]。原花青素的抗氧化、清除自由基的能力是VE的50倍、VC的20倍，還能防治80多種由自由基引起的疾病，包括心臟病、關(guān)節(jié)炎等[4]。此外它還具有防癌、抗癌、防止心血管疾病、抗輻射、抗衰老、抗疲勞作用，是歐美國家最受歡迎的植物藥之一[5]；原花青素中藥效活性高的部分為其低聚體（聚合度小于5），其含量高低為原花青素質(zhì)量指標(biāo)的關(guān)鍵[6-7]。原花青素已廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域[8]。市場對其需求量越來越大，因此尋找新的原花青素含量高且低聚體含量高，又適合于工業(yè)化生產(chǎn)的植物資源已成研究熱點(diǎn)[9]。由于爬山虎屬植物是原花青素的一種潛在資源植物，因此本文探討了粉葉爬山虎中低聚原花青素提取分離純化的方法及含量測定，為武陵山區(qū)資源豐富的爬山虎屬植物的綜合開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粉葉爬山虎 2010年10月25日采于桑植縣八大公山國家森林公園，洗凈取其果皮、種子、果梗45℃烘干，粉碎過40目篩，烘至恒重，石油醚脫脂，45℃密封保存?zhèn)溆?；無水乙醇、濃鹽酸、磷酸、5%NaOH、甲醇、乙酸乙酯、石油醚、丙酮、香草醛 以上化學(xué)試劑均為分析純；原花青素標(biāo)準(zhǔn)品 中國上海鑫馬生物科技有限公司，98%，以兒茶素、表兒茶素及其二聚體為主；顯色劑 A∶B=6∶3（現(xiàn)配現(xiàn)用），A：香草醛-甲醇溶液（稱取10.000g香草醛溶于甲醇溶液中，定容到250mL，得到0.04g/mL的香草醛-甲醇溶液），B：濃鹽酸；各種樹脂 中國西安藍(lán)曉科技公司。

ZM-1植物樣品粉碎機(jī)，LC-20A高效液相色譜儀，AEG-220萬分之一電子天平 日本島津公司；Lambda-25紫外可見分光光度計(jì) 美國PerkinElmer公司；LD5-2A離心機(jī) 中國北京醫(yī)用有限公司；DF-42鼓風(fēng)干燥箱 日本Yamato公司；R-215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀瑞士BUCHI公司；HH-6電子恒溫水浴鍋 中國富華儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線測定 精密稱取原花青素標(biāo)準(zhǔn)品0.500g（平行3份，取其平均值，未加說明下文均同）溶于甲醇溶液，定容到500mL容量瓶中，得到質(zhì)量濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5mL于10mL容量瓶中，分別加入A溶液6.0mL與B溶液3.0mL，并定容于10mL容量瓶中，恒溫（30℃）避光反應(yīng)30min。以A溶液∶B溶液∶水=6∶3∶1（V∶V∶V）的混合溶液作對照，于紫外分光光度計(jì)上從200～800nm自動掃描，結(jié)果見圖1。

從濃度為1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液中分別取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL，各加入A溶液6.0mL和B溶液3.0mL，并定容于10mL容量瓶中。按上法在紫外分光光度計(jì)上測其A520nm值。

1.2.2 HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱為Hypersil ODS C18（150× 4mm，5μm），柱溫30℃，進(jìn)樣量為10μL，流動相為甲醇-0.4%磷酸（1∶1），流速為1mL/min，檢測波長280nm。

1.2.2.2 HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取原花青素標(biāo)準(zhǔn)品0.000、2.500、5.000、7.500、10.000mg用甲醇溶解于10mL容量瓶中，并用甲醇定容，以甲醇為對照品，按1.2.2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行檢測。

1.2.3 各單因素對原花青素得率的影響

1.2.3.1 提取溫度對原花青素得率的影響 稱取3.000g脫脂種子粉末7份，以體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇溶液作為溶劑，料液比為1∶10（g/mL），調(diào)pH為5，分別在30、45、55、65、75、85、95℃水浴中浸提1h，在紫外分光光度計(jì)上測A520nm值。

1.2.3.2 提取時(shí)間對原花青素提取率的影響 取3.000g脫脂種子粉末7份，以體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇溶液作為溶劑，料液比為1∶10（g/mL），調(diào)pH為5，在（65±1）℃水浴中分別浸提20、40、60、80、100、120、140min，在紫外分光光度計(jì)上測A520nm值。

1.2.3.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對原花青素提取率的影響 稱取3.000g脫脂種子粉末7份，按1∶10（g/mL）的料液比，調(diào)pH為5，以體積分?jǐn)?shù)為30%、45%、55%、65%、75%、85%、95%的乙醇溶液作為溶劑，在65℃水浴中浸提1h，在紫外分光光度計(jì)上測A520nm值。

1.2.3.4 料液比對原花青素提取率的影響 稱取3.000g脫脂種子粉末7份，以體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇溶液作為溶劑，調(diào)pH為5，料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL），在65℃水浴中浸提1h，在紫外分光光度計(jì)上測A520nm值。

1.2.4 粉葉爬山虎原花青素提取條件的優(yōu)化 根據(jù)單因素考察的乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比以及提取時(shí)間對原花青素提取率的綜合影響，采用L16（45）正交表設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，因素水平安排見表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果和方差分析見表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.2.5 粉葉爬山虎原花青素的提取與初步分離純化 稱取100.000g脫脂的野生粉葉爬山虎果梗、果皮和種子粉末，加入1000mL體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液，在65℃條件下提取100min，抽濾，濾液濃縮，按文獻(xiàn)[10-11]中方法進(jìn)行提取與純化，得原花青素初步純化物，對其進(jìn)行Uv法測定。

1.2.6 原花青素的樹脂分離純化

1.2.6.1 大孔樹脂的篩選 10種樹脂預(yù)處理按文獻(xiàn)[12]進(jìn)行。在50mL的錐形瓶中加入5.000g（相當(dāng)于干質(zhì)量，下同）經(jīng)處理的樹脂，再加入15mL濃度為1.0mg/mL的原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液，封口，于室溫振蕩吸附24h，過濾，測定濾液中原花青素的質(zhì)量濃度，計(jì)算各樹脂的吸附率。

用30mL體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液對已吸附原花青素的樹脂進(jìn)行解吸實(shí)驗(yàn)，測定解吸液中原花青素的質(zhì)量濃度，計(jì)算解吸率[13]。根據(jù)吸附率與解吸率篩選樹脂。

1.2.6.2 進(jìn)樣濃度對樹脂吸附速率的影響[14]準(zhǔn)確稱取20.000g處理好的樹脂于錐形瓶中，分別加入100mL初始質(zhì)量濃度為40、20、10mg/mL的原青花素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置于30℃恒溫?fù)u床中振蕩（150r/min），每隔10min取樣測定溶液中原花青素含量，按照如下公式計(jì)算原花青素在吸附樹脂上的吸附速率，即：q＝（C0－Ct）×V/W，其中，C0-溶液初始質(zhì)量濃度（mg/mL）；Ct-t時(shí)刻的質(zhì)量濃度（mg/mL）；V-溶液體積（mL）；W-樹脂質(zhì)量（g）。記錄不同進(jìn)樣濃度在LSA-21樹脂上150min內(nèi)吸附速率，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸附速率為縱坐標(biāo)作圖（圖7）比較分析進(jìn)樣濃度對樹脂吸附速率的影響。

1.2.6.3 LSA-21樹脂動態(tài)吸附量與洗脫劑流速選擇 取40.000g LSA-21樹脂（濕質(zhì)量、5份）按濕法裝柱，分別用0.5、1.0、1.5、2.0、3.0BV/h的流速對1.2.5項(xiàng)原花青素溶液進(jìn)樣，按每管5mL收集流出液，稀釋至10mL，測定流出液中原花青素含量，直至流出液中原花青素濃度與加入液一致為止，據(jù)此計(jì)算出樹脂的動態(tài)吸附容量。然后用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液分別以1.0、2.0、3.0、4.0、5.0BV/h的流速對其進(jìn)行洗脫，按每管5mL收集洗脫液，稀釋至10mL，測定各管洗脫液中原花青素含量，確定洗脫劑的流速。

1.2.7 粉葉爬山虎原花青素樹脂分離純化 用甲醇溶解1.2.5項(xiàng)初步純化的原花青素，并定容于300mL容量瓶中，提取液在大孔吸附樹脂LSA-21柱上吸附24h，用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇洗脫溶液以2BV/h的流速對其進(jìn)行洗脫，洗脫液濃縮并定容于100mL容量瓶中，進(jìn)行HPLC與Uv法檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 原花青素紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線

從紫外分光光度計(jì)自動掃描圖（圖1）中發(fā)現(xiàn)原花青素的最大吸收波長為520nm[15-18]。紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線測定后，計(jì)算得回歸方程：y=0.0087x+0.0046，r=0.9980。

圖1 原花青素紫外自動掃描圖Fig.1 Proanthocyanidins ultraviolet automatic scanning map

2.2 HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖2 HPLC原花青素標(biāo)準(zhǔn)品圖Fig.2 HPLC standard curve of proanthocyanidins

按1.2.2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行HPLC測定，以質(zhì)量濃度與峰面積計(jì)算得回歸方程：y=6659.8x+23714，r=0.9993。 HPLC檢測原花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的圖譜見圖2。

2.3 單因素對原花青素得率的影響

由圖3～圖6可知：溫度在30～75℃范圍內(nèi)原花青素得率呈線性上升，在75℃左右達(dá)到得率高點(diǎn)，然后開始下降，結(jié)合高溫對原花青素的影響，本文選取提取溫度為55、65、75、85℃進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)；提取時(shí)間在20～60min內(nèi)原花青素得率變化較大，但時(shí)間少于40min其得率又太低，大于40min后其得率變化較小，因此本文選擇提取時(shí)間為40、60、80、100min進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)；乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)在30%～75%范圍內(nèi)原花青素得率呈上升趨勢然后開始下降，但在55%以下時(shí)其得率較低，因此選擇乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)55%、65%、75%、85%進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)；料液比在1∶5、1∶10、1∶15（g/mL）范圍時(shí)原花青素得率呈上升趨勢，之后上升趨勢比較平緩，而低于1∶5（g/mL）時(shí)溶液已不能完全浸沒原料，因此選擇料液比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20（g/mL）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖3 不同溫度下所提原花青素的吸光值Fig.3 Proanthocyanidin absorption value under different temperature

圖4 不同提取時(shí)間所提原花青素的吸光值Fig.4 Proanthocyanidin absorption value under different extraction time

圖5 不同乙醇濃度所提取原花青素的吸光值Fig.5 Proanthocyanidin absorption value under different alcohol concentration

圖6 不同料液比所提原花青素的吸光值Fig.6 Proanthocyanidin absorption value under different ratio of solid to liquid

2.4 粉葉爬山虎種子中原花青素提取工藝優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇溫度、提取時(shí)間、乙醇濃度、液料比等較優(yōu)水平，按L16（45）設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與方差分析見表2。由表2可知，影響原花青素提取率的因素順序?yàn)椋簻囟龋ˋ）＞料液比（D）＞提取時(shí)間（B）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）。其提取最優(yōu)組合為A4B4C3D2，即提取工藝參數(shù)為溫度85℃、提取時(shí)間100min、乙醇體積分?jǐn)?shù)75%和料液比1∶10。但綜合考慮提取溫度過高對原花青素穩(wěn)定性產(chǎn)生的影響以及節(jié)約能源，同時(shí)考慮A4與A2的k2、k4值相差較小，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果在降低提取溫度的同時(shí)維持較長的提取時(shí)間而達(dá)到最佳的提取效果，因此本實(shí)驗(yàn)選擇A2B4C3D2，即提取工藝參數(shù)為溫度65℃、提取時(shí)間100min、乙醇體積分?jǐn)?shù)75%和料液比1∶10。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiments

2.5 Uv法檢測初步純化的原花青素結(jié)果

粉葉爬山虎種子、果皮、果梗干粉中原花青素按優(yōu)化工藝條件提取，經(jīng)石油醚與乙酸乙酯萃取后，香草醛-鹽酸法顯色，紫外檢測，計(jì)算得果梗、果皮、種子中原花青素的平均含量為2.6317%、3.7967%、4.0934%。

2.6 大孔吸附樹脂分離純化原花青素

2.6.1 分離樹脂的篩選 10種大孔吸附樹脂對粉葉爬山虎種子中原花青素的靜態(tài)吸附結(jié)果見表3，可知10種樹脂中有4種可實(shí)現(xiàn)80%以上吸附率，解吸率80%以上的也有5種，綜合吸附率和解吸率，LSA-21型樹脂吸附量為41.7mg/g，吸附率達(dá)92.7%，解吸率也達(dá)到89.6%。故本實(shí)驗(yàn)選擇LSA-21樹脂為原花青素分離純化樹脂。

表3 不同樹脂的吸附及解吸性能比較Table 3 Comparison of different resin adsorption and desorption performance

2.6.2 進(jìn)樣濃度對樹脂吸附速率的影響 由圖7可知，進(jìn)樣濃度越高，達(dá)到吸附平衡所需的時(shí)間越短，說明吸附速率與溶液濃度有相關(guān)，但不同濃度的平衡時(shí)間相差不大，如當(dāng)平衡質(zhì)量濃度為40mg/mL時(shí)，平衡所需時(shí)間為30min，而濃度20mg/mL時(shí)平衡時(shí)間為33min，兩者相差不大，因此本文選擇進(jìn)樣濃度為20mg/mL。

圖7 原花青素在LSA-21樹脂上的吸附速率Fig.7 Adsorption rate of LSA-21 resin on proanthocyanidins

2.6.3 LSA-21樹脂動態(tài)吸附量與洗脫劑流速選擇 當(dāng)流經(jīng)吸附柱的原花青素溶液體積達(dá)到兩倍床層體積時(shí)，流出液的濃度基本不變，接近飽和吸附；當(dāng)流出液體積從15mL升至22mL時(shí)，流出液中原花青素濃度急劇增高，22mL以后，流出液中原花青素濃度幾乎不變，說明此時(shí)樹脂對原花青素吸附飽和。據(jù)此計(jì)算出LSA-21樹脂動態(tài)吸附容量為156.4mg/g。洗脫液流速為1.0、2.0、3.0BV/h時(shí)，洗脫效果相差不大，當(dāng)洗脫液流速達(dá)到4.0BV/h時(shí)，洗脫效果明顯減弱，但是如果流速太小，解吸速度就慢，因此本實(shí)驗(yàn)選擇洗脫液流速為2.0BV/h。

2.7 LSA-21樹脂分離純化后原花青素的HPLC檢測

經(jīng)過LSA-21大孔吸附樹脂分離純化的野生粉葉爬山虎種子、果皮中原花青素HPLC檢測圖譜見圖8、圖9，分離純化后的各種原花青素與標(biāo)準(zhǔn)品成分基本一致。而果梗中原花青素經(jīng)同樣方法處理后，HPLC檢測（圖10）發(fā)現(xiàn)其與標(biāo)準(zhǔn)品的檢測圖譜在3.2min均有出峰外，其它出峰時(shí)間與峰數(shù)存在差異，說明果梗中所含成分與標(biāo)準(zhǔn)品及果皮、種子有差異，這主要是原花青素是一大類由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素單體及其聚合體形成的多酚類化合物，雖然它在植物不同部位廣泛存在，但不同部位所含單體種類及聚合程度不一樣。野生粉葉爬山虎種子、果皮與果梗中原花青素存在哪些差異成分有待進(jìn)一步研究。

圖8 種子中原花青素HPLC檢測圖譜Fig.8 HPLC detection chart of proanthocyanidins in seed

圖9 果皮中原花青素HPLC檢測圖譜Fig.9 HPLC detection chart of proanthocyanidins in fruit peel

圖10 果梗中原花青素的HPLC檢測圖譜Fig.10 HPLC detection chart of proanthocyanidins in fruit stem

2.8 樹脂分離純化后原花青素含量的測定

各種原花青素提取液經(jīng)LSA-21樹脂分離純化后，用HPLC檢測，按歸一法計(jì)算得果梗、果皮、種子中平均含量為2.39%、2.31%、3.94%，純度均達(dá)87%以上。

3 結(jié)論

3.1 通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)并經(jīng)方差分析優(yōu)選出粉葉爬山虎種子、果皮、果梗中原花青素提取較佳條件：提取時(shí)間100min，乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，提取溫度65℃，料液比1∶10。紫外檢測果梗、果皮、種子中原花青素平均含量為2.6317%、3.7967%、4.0934%。

3.2 從10種樹脂中篩選出較佳的LSA-21樹脂，分離時(shí)進(jìn)樣質(zhì)量濃度為20mg/mL，洗脫液流速為2.0BV/h，以體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇為洗脫液，經(jīng)LSA-21樹脂分離純化，HPLC檢測，計(jì)算得果梗、果皮、種子中原花青素含量為2.39%、2.31%、3.94%；原花青素純度均達(dá)87%以上，且與以兒茶素、表兒茶素及其二聚體為主的標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜一致。

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Extraction technique conditions of procyanidins from seed and other parts of wild grown Parthenocissus thomsonili planch and its content determination

DONG Ai-wen1，ZHU Shen-hai2，WANG Guo-qing1
（1.HunanProvincalKeyLaboratoryofForestProductsandChemicalEngineering，JishouUniversity，Zhangjiajie427000，China；2.College of Rural-Urban Resources and Planning Science，Jishou University，Zhangjiajie 427000，China）

Orthogonal experiments were designed for optimization of the extraction and purification technologic conditions of procyanidins from Parthenocissus thomsonili planch.Results showed that extraction for 80min，ethanol volume fraction of 75%，the optimum combined conditions were extraction temperature at 65℃，solution ratio of 1∶10.After preliminary purification of extract solution，color reactions produced by vanillin hydrochloric acid method，the average procyanidins contents of stem，fruit peel and seed determined by ultraviolet spectrophotometry method were 2.6317% ，3.7967%，4.0934%respectively.The results of isolation and purification of procyanidins by macroporous absorptive resin showed that LSA-21 was suitable for isolation and purification of procyanidins from Parthenocissus thomsonili planch，the optimum conditions of column isolation were that the mass concentration of initial feed solution was 20mg/mL，eluting speed was 2.0BV/h.The average contents of purified procyanidins of fruit peel，seed and stem determined by high performance liquid chromatography（HPLC）and ultraviolet spectrophotometry were 2.39%，2.31%，3.94%respectively.The purities of procyanidins purified by LSA-21 and determined by HPLC reached above 87%.

Parthenocissus thomsonili planch；procyanidins；isolation and extraction；HPLC

TS201.2

B

1002-0306（2012）05-0230-05

2011－04－25

董愛文（1967-），男，副教授，碩士，主要從事植物及其有效成分研究。

湖南省科技廳資助項(xiàng)目（2011NK3043）；湖南省科技廳課題（2008TP4008-3）；張家界市科技局課題（2010YB010）。