李云龍，陜 方，胡俊君

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，山西太原030031）

高效液相色譜法測定老陳醋中的γ-氨基丁酸

李云龍，陜 方，胡俊君

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，山西太原030031）

通過采用10%三氯乙酸水溶液對老陳醋樣品進(jìn)行預(yù)處理，以鄰苯二甲醛（OPA）、氯甲酸-9-芴基甲酯（FMOCCL）為衍生劑，用反相C18柱為分離柱，柱溫40℃，梯度洗脫，在EX：250nm，EM：410nm下檢測，建立了OPA柱前自動(dòng)衍生-熒光檢測老陳醋中γ-氨基丁酸（GABA）的HPLC法。結(jié)果表明，老陳醋中的GABA獲得了很好的分離，GABA在0.004～0.30mg/mL范圍內(nèi)線性相關(guān)性好，其線性方程為Y=26016X-38.72（R2=0.9994），加樣平均回收率達(dá)到了96.22%以上。該方法穩(wěn)定、靈敏、重現(xiàn)性好，可用于測定老陳醋中GABA含量定量分析。

高效液相色譜，老陳醋，γ-氨基丁酸

γ-氨基丁酸（GABA）是一種廣泛分布于動(dòng)、植物體內(nèi)的非蛋白質(zhì)氨基酸，是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[1]。已有研究表明：GABA具有降血壓、鎮(zhèn)痛安神、改善神經(jīng)機(jī)能、增進(jìn)肝功能、活化腎功能、促進(jìn)長期記憶、改善失眠、更年期障礙和老年精神障礙、促進(jìn)酒精代謝、預(yù)防肥胖等生理功能[2]。老陳醋中GABA含量對其降血壓，改善肝、腎功能，促進(jìn)乙醇代謝等多種生理活性的影響[3]，已成為學(xué)界關(guān)注的研究熱點(diǎn)之一。因此，建立適合測定老陳醋中GABA的方法，對進(jìn)一步揭示老陳醋的功能機(jī)理、評價(jià)老陳醋保健功效，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前測定GABA的方法有：放射受體法、薄層掃描法、高效液相色譜法、氨基酸分析儀和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，其中高效液相色譜法是最常用的方法[4]。由于GABA對電化學(xué)和紫外可見光不夠敏感，直接測定比較困難。通常采用衍生化反應(yīng)，生成對紫外和熒光較為敏感的衍生化物質(zhì)再進(jìn)行測定。由于老陳醋特殊的生產(chǎn)工藝，產(chǎn)品中固形物含量高、基質(zhì)成分復(fù)雜、色澤深，而GABA含量相對較低，因此對老陳醋中GABA的定量分析造成一定的困難。本文在參考國內(nèi)外文獻(xiàn)測定GABA方法的基礎(chǔ)上[5-9]，擬建立一種快速、準(zhǔn)確測定山西老陳醋中GABA含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

GABA（含量≥99.0%）、乙腈（含量≥99.90%）Sigma公司；FMOC-Cl（含量≥99.0%） Fluca公司；OPA（含量≥99.0%） 上海盈元化工有限公司；三氯乙酸（含量≥99.0%） 天津市大茂化學(xué)試劑廠；其余試劑 均為分析純。

1100液相色譜儀 美國Agilent科技公司；EB-330H型分析天平 日本島津公司；HH-2電子恒溫水浴鍋 蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司；P型可調(diào)式移液器 法國GILSON；5418R小型臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國Eeppendorf。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 吸取5.000mL醋樣，加入5.000mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸，沉淀2h后，用雙層濾紙過濾，取濾液1.000mL加入1.000mL 10%的三氯乙酸，14000r/min離心20min，上清液經(jīng)0.45μm纖維素膜過濾后，檢測GABA含量。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：Hypersil BDS C18（250mm× 4.6mm，5μm），流動(dòng)相：A為1.6g NaAC·3H2O，pH6.70，1000mL；B為1.6g NaAC·3H2O，水∶甲醇∶乙腈為1∶2∶2為溶劑，pH6.70，1000mL；流速：1.0mL/min；柱溫：40℃；熒光檢測器，λEx：250nm，λEm：410nm，其自動(dòng)衍生化步驟如表1所示，梯度洗脫如表2所示。

表1 自動(dòng)衍生化步驟Table 1 Automated derivatization step

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取GABA標(biāo)準(zhǔn)品，用60%的乙醇溶解配成0.50mg/mL，備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 對照品液和樣品液的色譜分離圖

在選定的色譜條件下，對照品液和樣品液色譜圖見圖1和圖2，從圖中可以看出，GABA在14.669min出峰，峰形好，無雜質(zhì)峰干擾。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

表3 精密度及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Experimental results of precision and stability

將上述配制好的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別稀釋配成0.004、0.008、0.016、0.02、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、 0.30mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣檢測，以濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=26016X-38.72（R2=0.9994），線性范圍為0.004～0.30mg/mL。

圖1 GABA標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.1 GABA standard chromatogram

圖2 山西老陳醋色譜圖Fig.2 Shanxi old mature vinegar chromatogram

2.3 精密度及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取0.04mg/mL的GABA標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)進(jìn)樣測定（n=5），精密度測定結(jié)果見表3，測得的峰面積平均值為1097.7，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.439%，小于2.0%；另外按照方法1.2.1處理樣品5份后，取濾液進(jìn)樣，穩(wěn)定性測定結(jié)果見表3，其色譜圖如圖2所示，其峰面積平均值為486.58，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.063%。

2.4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

取2.500mL山西老陳醋樣品3份，分別加入2.500mL 0.06、0.08、0.10mg/mL GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液（平行3份），按1.2.1處理樣品后，取濾液，按照1.2.2色譜條件測定，按2.2項(xiàng)下回歸方程計(jì)算出GABA的回收率，結(jié)果見表4。

表4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）Table 4 Results of recovery rate（n=3）

3 討論

結(jié)果表明，本文建立的OPA柱前自動(dòng)衍生-熒光檢測老陳醋中GABA的方法，測量峰形好，樣品無雜質(zhì)干擾，靈敏度高、工作曲線線性良好，操作簡便，其精密度、穩(wěn)定性、回收率等指標(biāo)均可滿足要求。樣品衍生化過程利用液譜儀的自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)行，可消除樣品衍生化時(shí)的手動(dòng)操作誤差，顯著提高其重復(fù)性。該方法可用于老陳醋中GABA的定性、定量分析，且快速準(zhǔn)確。

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Determination ofγ-amino butyric acid in mature vinegar by HPLC

LI Yun-long，SHAN Fang，HU Jun-jun
（Institute of Agro-Food Science Technology，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031，China）

A method for γ-Amino Butyric Acid（GABA）determination in mature vinegar with ortho-phthaladehyde（OPA）automatic pre-column derivation and fluorescence detection by high performance-liquid chromatography was established.Firstly mature vinegar was pretreated with trichloroacetic acid of 10%，derived OPA and 9-fluorenylmethyl chloroformate（FMOC-CL），and then separated and assayed with reversed phase C18column，finally eluted at 40℃ and determinated by HPLC at EX：250nm，EM：410nm.The result showed that GABA in mature vinegar was separated well with this method，and in the range of 0.004～0.30mg/mL of calibration curve，GABA kept linear with regression equation of Y=26016X-38.72（R2=0.9994）.The relative error was 96.22%，which indicated that method was a sensitive，reproduced and specific assay for the determination of GABA in mature vinegar.

HPLC；mature vinegar；γ-amino butyric acid

TS264.2+2

A

1002-0306（2012）05-0328-03

2011-04-25 *通訊聯(lián)系人

李云龍（1979-），男，碩士，助理研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品深加工研究。

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)燕麥?zhǔn)w麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-08-D-2）；山西省科技攻關(guān)課題（20100311066-2）。