徐 涵 周 麗 華漢威 王清章

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，武漢 430070)

豆類發(fā)酵液抑制馬鈴薯漿液褐變的研究

徐 涵 周 麗 華漢威 王清章

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，武漢 430070)

為了找到抑制褐變的替代方法，采用豌豆自然發(fā)酵液來進(jìn)行抗褐變和抑制馬鈴薯多酚氧化酶(PPO)活性的研究，并對其抗褐變機(jī)理和發(fā)酵條件進(jìn)行了初步的探索。結(jié)果表明，豌豆自然發(fā)酵液可以有效的抑制馬鈴薯漿液褐變;有機(jī)酸并不是影響發(fā)酵液抗褐變的主要因素，它能夠抗褐變是因為它可以抑制PPO的活性。通過單因素以及正交試驗，確定了豌豆自然發(fā)酵液的最佳發(fā)酵條件:發(fā)酵時間為2 d，發(fā)酵溫度為30℃，料水比為1∶5。經(jīng)過驗證，按最佳發(fā)酵條件得到的發(fā)酵上清液對PPO的抑制率可高達(dá)95.21%。

豌豆 自然發(fā)酵 褐變 多酚氧化酶(PPO)

馬鈴薯是茄科茄屬一年生草本植物，其塊莖可以供食用，是重要的糧食、蔬菜兼用作物。它富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)及人體必需氨基酸等營養(yǎng)成分，有“地下蘋果”之美稱［1］。鮮切馬鈴薯是一種新型的馬鈴薯初加工制品，因食用方便、快捷而備受消費者青睞［2］。然而馬鈴薯在經(jīng)過鮮切后，其多酚氧化酶(PPO)催化內(nèi)源多酚類底物氧化成醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)進(jìn)一步聚合成黑色素，從而導(dǎo)致鮮切馬鈴薯發(fā)生褐變現(xiàn)象，嚴(yán)重的影響其感官質(zhì)量和商品價值。

目前，生產(chǎn)上用亞硫酸鹽、檸檬酸、抗壞血酸(VC)、鋁(硼或鋅)化物等化學(xué)試劑來抑制酶促褐變［3］，或者對已褐變的產(chǎn)品進(jìn)行漂白粉漂白或二氧化硫熏白，但這些處理方法，有的具較強(qiáng)殘留毒性(如 SO2、Cl－、A13+等)，危害人體健康;而有的則效果不佳，價格昂貴［4］。而生物抗褐變劑近些年來受到了人們的廣泛關(guān)注和重視，利用有益菌及其代謝產(chǎn)物來防腐抑菌、保鮮抗褐變的研究方興未艾。在這種趨勢下，希望通過本試驗?zāi)軌蛏钊氚l(fā)掘微生物發(fā)酵液的防褐變潛能，使其能夠在生產(chǎn)應(yīng)用中發(fā)揮應(yīng)有的作用。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

馬鈴薯、豌豆:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菜市場。

鄰苯二酚、兒茶素、表兒茶素、綠原酸:Sigma公司。

722N型可見光分光光度計:上海光譜儀器有限公司;高速冷凍離心機(jī):美國Backman公司;生化培養(yǎng)箱:北京泰斯特儀器有限公司;恒溫水浴鍋:北京東方精瑞科技公司;AL204分析天平:海梅特勒－托斯多儀器有限公司;豆?jié){機(jī):移日本松下電器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 豌豆發(fā)酵液的制備及馬鈴薯褐變度(BD)的測定

豌豆洗凈后清水浸泡一晚，按1∶10加水打漿過濾，濾液放入三角瓶中密封，于恒溫培養(yǎng)箱中(25℃左右)靜置2～3 d，待發(fā)酵液的顏色由白變黃，氣味變酸，pH 4.6左右時即可，在12 000 r/min，4 ℃條件下離心15 min，取其上清液備用。

參照文獻(xiàn)［5］并加以改進(jìn)，馬鈴薯去皮清水沖洗后粗碎，按照1∶10加水(預(yù)冷)打漿，迅速過濾，濾液要現(xiàn)配現(xiàn)用。取豌豆發(fā)酵上清液0、1、2、3、4 mL分別裝入10 mL量筒并補(bǔ)水至4 mL，然后加入馬鈴薯漿液至10 mL刻度，混勻靜置10 min后于10 000 r/min，4℃條件下離心15 min，所得上清液在25℃水浴中保溫5 min，用分光光度計測定其吸光值，結(jié)果以A410×10表示，平行測定3次，取平均值。試驗測定時分別以0、1、2、3、4 mL發(fā)酵上清液補(bǔ)水至10 mL作為對照。

1.2.2 酚類物質(zhì)自氧化的測定

分別準(zhǔn)確稱取5.00 mg鄰苯二酚、綠原酸、兒茶素和表兒茶素，用100 mL，pH 6.5緩沖溶液溶解，酚類濃度為50 mg/L。各取10 mL于試管中，加入不同量的發(fā)酵上清液并補(bǔ)蒸餾水至20 mL。37℃水浴中保溫3.5 h，選擇波長為420 nm，測定吸光值。平行測定3次并取平均值。以相同的酚類溶液加10 mL蒸餾水做空白對照［6］。

1.2.3 馬鈴薯多酚氧化酶(PPO)的粗提取和活性的測定

參照文獻(xiàn)［7］并改進(jìn):馬鈴薯清洗去皮，取5 g左右切碎后加入一定量預(yù)冷的pH 6.5，0.1 mol/L磷酸緩沖液，冰浴研磨(研缽在－20～－25℃條件下預(yù)冷2～3 h)后迅速在7 500 r/min，4℃條件下離心20 min。所得上清液即為馬鈴薯多酚氧化酶(PPO)的粗酶液。

采用消光值法。參照文獻(xiàn)［8］并加以改進(jìn)，不同量的發(fā)酵上清液中加入pH 6.5的磷酸緩沖液至3 mL處，然后加入2 mL，0.2 mol/L的鄰苯二酚。25℃下保溫5 min，再加入1 mL的粗酶液，迅速混勻后在410 nm波長下記錄吸光值的變化。每0.5 min記錄1次吸光值，共計3 min，重復(fù)測定3次。一個酶活力單位(U)定義為測定條件下每分鐘引起吸光值增加0.001所需的酶量。

1.2.4 有機(jī)酸對馬鈴薯漿液BD值影響的測定

取pH 5.0的乳酸、檸檬酸，100 mg/L抗壞血酸溶液以及發(fā)酵液(調(diào)節(jié)至pH 5.0)各4.0 mL，分別加入到6.0 mL的馬鈴薯漿液中，混勻靜置后按照1.2.1的方法測定其BD 值。

1.2.5 自然發(fā)酵工藝

選取了發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和料水比這3個因素分別進(jìn)行單因素試驗，然后選取各因素中影響較大的水平來進(jìn)行正交試驗從而確定發(fā)酵的最佳條件。以3 mL發(fā)酵上清液對PPO的抑制率來評價發(fā)酵液的效果。正交試驗因素水平設(shè)計表見表1。

表1 因素水平表

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件對所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵上清液的防褐變試驗

分別取不同量的發(fā)酵上清液加入到馬鈴薯漿液中，混合均勻并離心后測定其褐變度(BD)值。

從表2可以看出，馬鈴薯漿液在用豌豆發(fā)酵上清液處理后，其褐變度(BD)下降，而且隨著上清液量的增加，BD值呈現(xiàn)下降的趨勢。在沒有加入上清液時，馬鈴薯漿液的BD值為1.91;而當(dāng)加入1.0 mL的上清液后BD值下降到1.79;而加入4.0 mL后，其BD值下降到只有0.83。經(jīng)過統(tǒng)計分析，其曲線回歸方程為 y=2.050 6e－0.22x，其中 R=0.960 3 ＞ R0.01=0.959，所以上清液加量與馬鈴薯漿液的褐變度(BD)呈極顯著的負(fù)相關(guān)。這表明豌豆發(fā)酵上清液能夠有效抑制馬鈴薯漿液的褐變。

表2 上清液對褐變度的影響

2.2 發(fā)酵上清液抑制酚類物質(zhì)試驗

酶促褐變反應(yīng)的發(fā)生需要3個條件:酚類底物、酶類物質(zhì)和氧。酚類物質(zhì)是酶促褐變的重要底物，其種類繁多包括鄰苯二酚(兒茶酚)、綠原酸、咖啡酸、沒食子酸等［5］。由于不知道發(fā)酵上清液是直接作用于酚類物質(zhì)而抑制其氧化，還是抑制多酚氧化酶的活性，故用上清液分別驗證。圖1是發(fā)酵上清液對不同酚類物質(zhì)自氧化的影響。

圖1 上清液對酚類自氧化的影響

從圖1可見，隨著上清液加入量的增加，4種酚類溶液的吸光度變化呈上升趨勢。這說明對于酚類的自氧化作用，上清液并不能起到抑制效果，反而會促進(jìn)酚類的自氧化。其原因可能是因為上清液的pH比較低(約pH 4.6)，加入上清液后降低了溶液的pH，從而促進(jìn)了酚類的自氧化。

2.3 發(fā)酵上清液抑制多酚氧化酶(PPO)試驗

多酚氧化酶(PPO)催化酚類物質(zhì)的氧化。PPO的系統(tǒng)命名是鄰二酚:氧－氧化還原酶，該酶以銅為輔基，是一種含銅蛋白質(zhì)，其相對分子質(zhì)量約為34 000，必需以氧氣為受氫體，是一種末端氧化酶［9］。

圖2 上清液對PPO活性的影響

從圖2可以明顯的看出，當(dāng)上清液的加入量增大時，其對馬鈴薯PPO的抑制率也隨之增大，即對馬鈴薯PPO活性的抑制作用增大。當(dāng)加入發(fā)酵液體積為0.5 mL時，其對PPO活性的抑制率為33.67%;而當(dāng)加入3 mL時，對 PPO活性的抑制率則高達(dá)88.25%，此后發(fā)酵液的加入量再增大時，PPO抑制率的變化不大。這說明發(fā)酵液可以有效的抑制馬鈴薯PPO的活性。

2.4 有機(jī)酸對馬鈴薯漿液BD值的影響

為了驗證是否發(fā)酵液中所含的有機(jī)酸對抗褐變起作用，選取pH 5.0的乳酸、檸檬酸，100 mg/L抗壞血酸溶液和發(fā)酵液(調(diào)節(jié)至pH 5.0)來進(jìn)行抗褐變試驗。

表3 有機(jī)酸對褐變度的影響

根據(jù)表3可以看到，pH 5.0的發(fā)酵液有較好的抑制褐變的效果，可以顯著的降低馬鈴薯漿液的BD值，而且發(fā)酵液組的BD值為0.81，小于抗壞血酸組的BD值，說明其抗褐變效果比抗壞血酸更好。檸檬酸組與蒸餾水組的BD值大致相同，而乳酸不僅沒有起到防褐變效果，其BD值比蒸餾水對照組還要大。這可能是因為加入乳酸、檸檬酸溶液后整個溶液體系的pH值上升到了5.5左右，而馬鈴薯PPO的活性在pH 5.5時達(dá)到最大;再加上它們的濃度太低，在一定程度上起到了激活PPO的作用。因此發(fā)酵液能夠抑制褐變并不是其中的有機(jī)酸起主導(dǎo)作用，但是這些有機(jī)酸的存在降低了發(fā)酵液的pH，有助于發(fā)酵液對馬鈴薯PPO活性的抑制，至于是何種物質(zhì)起著抑制褐變的效果則還需要后續(xù)試驗來加以驗證。

2.5 豌豆自然發(fā)酵液的工藝試驗

因為發(fā)酵的方式為自然發(fā)酵，影響因素有很多，現(xiàn)選取自然發(fā)酵溫度，自然發(fā)酵時間和料水比這3個條件進(jìn)行單因素和正交試驗，尋找最好的發(fā)酵條件來提高發(fā)酵液的抗褐變效果。

2.5.1 自然發(fā)酵時間對抑制 PPO活性的影響

在發(fā)酵溫度為25℃，料水比為1∶10時，選取的發(fā)酵時間分別為 1、2、3、4、5 d，研究經(jīng)過不同時間的發(fā)酵，發(fā)酵上清液對PPO活性的影響。

圖3 不同發(fā)酵時間的上清液對PPO的影響

從圖3中可以看出，隨著上清液加入量的增加，對PPO的抑制率增大，PPO的活性降低。經(jīng)過不同時間的發(fā)酵，上清液對PPO的抑制率不同。經(jīng)過5 d的發(fā)酵，上清液對PPO的抑制效果和3 d的相差不大，而在發(fā)酵4 d后的效果最好。

2.5.2 自然發(fā)酵溫度對抑制 PPO活性的影響

在發(fā)酵時間為3 d，料水比為1∶10時，選取的發(fā)酵溫度分別為20、25、30和35℃，研究在不同的發(fā)酵溫度下，發(fā)酵液對PPO活性的影響。

圖4 不同溫度發(fā)酵的上清液對PPO的影響

從圖4可以看到，隨著上清液加量的增加，PPO抑制率增大，其活性越來越小。在不同的發(fā)酵溫度下，上清液對PPO的抑制作用不同。20℃發(fā)酵條件下，上清液對PPO的抑制作用最小;而在30℃發(fā)酵條件下，其對PPO的抑制效果最好。

2.5.3 料水比對酸漿抑制PPO活性的影響

在發(fā)酵時間為3 d，發(fā)酵溫度為25℃時，選取的料水比分別為 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20，研究在不同的料水比條件下進(jìn)行自然發(fā)酵，發(fā)酵上清液液對PPO活性的抑制效果。

圖5 不同料水比的上清液對PPO的影響

根據(jù)圖5可以看出，不同料水比的豌豆?jié){液發(fā)酵后，上清液對PPO的抑制作用差異很大。當(dāng)料水比為1∶20時，對PPO的抑制作用最小;而料水比為1∶5時，對PPO的抑制作用最好，而1∶10時抑制效果和1∶5時差異不是很大。

2.5.4 正交試驗

為了確定最佳的發(fā)酵條件，現(xiàn)以發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、料水比這3項因素，分別設(shè)計3個水平進(jìn)行正交試驗［10－12］，正交試驗結(jié)果及方差分析見表4和表5。

表4 正交試驗結(jié)果

表5 方差分析

經(jīng)過對表4和表5的分析可知，影響上清液抑制PPO效果的因素順序為C＞A＞B。其中料水比的F值為 61.071 8，大于 F0.05(2，2)=19，因此具有顯著性影響;而發(fā)酵時間，發(fā)酵溫度的 F值分別是1.268 0，0.970 9，都小于 F0.10(2，2)=9，因此各個水平間無顯著的差異，對發(fā)酵液效果的影響相對較弱。最后確定了發(fā)酵的最佳條件為A1B2C1，即發(fā)酵時間為2 d，發(fā)酵溫度為30℃，料水比為1∶5。經(jīng)過驗證，按最佳發(fā)酵條件得到的上清液，3 mL對PPO活性的抑制率為 95.21%。

3 結(jié)論

用發(fā)酵液分別對馬鈴薯漿液、多酚類物質(zhì)和馬鈴薯PPO進(jìn)行抑制試驗。向馬鈴薯漿液中加入發(fā)酵液后其BD值為0.83，而未加發(fā)酵液的BD值為1.91，這說明發(fā)酵液可以有效抑制馬鈴薯漿液的褐變;發(fā)酵液的加入量越多，多酚溶液吸光值增加越大，它的自氧化速度越快，表明發(fā)酵液不能抑制多酚物質(zhì)自氧化，反而對其有促進(jìn)作用;發(fā)酵液對馬鈴薯PPO活性有較好的抑制效果，當(dāng)加入3 mL時，對PPO的抑制率可以達(dá)到88.2%;發(fā)酵液能夠抑制褐變并不是其中的有機(jī)酸起主導(dǎo)作用，但是這些有機(jī)酸降低了發(fā)酵液的pH，有助于對馬鈴薯PPO活性的抑制。由以上可以初步的推斷，發(fā)酵液能夠抗褐變是因為它可以有效的抑制PPO的活性。

為了得到抗褐變效果較好的發(fā)酵液，對發(fā)酵條件進(jìn)行初步摸索，采用單因素及正交試驗，確定了最優(yōu)的發(fā)酵條件:發(fā)酵溫度為30℃;發(fā)酵時間為2 d;料水比為1∶5。經(jīng)過驗證，在此條件下得到的發(fā)酵液，其抗褐變效果最好，3 mL發(fā)酵液對馬鈴薯PPO的抑制率高達(dá)95.21%。

［1］曾順德，張迎君，漆巨容.鮮切馬鈴薯絲褐變抑制劑篩選［J］.食品工業(yè)科技，2006，27(2):90 －91

［2］劉靜，李湘利，馮磊，等.鮮切馬鈴薯多酚氧化酶酶學(xué)特性及褐變抑制劑的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(34):17067－17069

［3］胡小松，喻紹春.馬鈴薯絲加工中的褐變因素及其控制［J］.食品科學(xué)，1994(5):35 －42

［4］侯金鐸，白寶蘭.以基質(zhì)絡(luò)合化法防止果蔬酶促褐變的研究［J］.食品科學(xué)，1991，8(5):6－11

［5］李全宏，趙雅松，蔡同一，等.鮮切馬鈴薯褐變抑制效果研究［J］.食品科學(xué)，2005，26(9):92－95

［6］Kwak E J，Lim S I.The effect of sugar，amino acid，metal ion and NaCl on model Maillard reaction under pH control［J］.Amino Acids，2004，27:85 －90

［7］秦禮康，江萍，張倩，等.微生物發(fā)酵酸漿對馬鈴薯漿液的防褐研究［J］.食品科學(xué)，1997，18(1):32－37

［8］孟雅，李剛，崔焱，等.馬鈴薯多酚氧化酶的提取純化條件對其活性影響的研究［J］.化學(xué)與生物工程，2006，23(10):47－49

［9］劉紅錦，徐為民，王靜，等.果蔬的褐變及其控制方法［J］.食品研究與開發(fā)，2008，29(4):159－162

［10］張學(xué)杰，劉宜生，金黎平，等.馬鈴薯絲加工中抗褐變保鮮劑的篩選［J］.食品科學(xué)，1999，20(6):33 －35

［11］劉玉紅，王鳳山.正交試驗設(shè)計優(yōu)化茶藨子木層孔菌總多糖的提取條件［J］.食品與藥品，2009，11(5):20－22

［12］龐會忠，彭龍慧，張金波，等.馬尾松毛蟲多功能氧化酶測定正交試驗優(yōu)化研究［J］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，30(3):476－479.

Study on the Browning－Prevention of Potato Slurry by Pea Fermentation Liquid

Xu Han Zhou LiHua HanweiWang Qingzhang
(Institute of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070)

To find alternative methods for the control of browning，the experiment was designed to prevent the browning and polyphenol oxidase activity in potato slurry by pea fermentation liquid and its anti－browning mechanism and fermentation conditions was preliminary explored.The results showed that the pea fermentation liquid had better anti－browning effect of potato slurry;and it could inhibit browning because it could inhibit the activity of polyphenol oxidase;organic acid was not the main factors to inhibit browning.The single factor and orthogonal experiments determined the optimum conditions of pea natural fermentation:fermentation time of two days，fermentation temperature of 30 ℃，and material water ratio was 1∶5.It proved that the PPO inhibitory rate of fermentation liquid was 95.21%under the optimum conditions.

pea，natural fermentation，browning，polyphenol oxidase(PPO)

TS255.1

A

1003－0174(2012)09－0035－05

國家自然科學(xué)基金項目(31071619)

2011－12－06

徐涵，男，1985年出生，碩士，農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏