李桂偉 周慶民 樊興冬 馮萬宇 秦 博 高俊峰

（黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，齊齊哈爾 161006）

隨著生活水平的日益提高，犬在人類的生活中占據(jù)越來越重要的地位，如作為寵物、警犬、搜救犬等。但是，犬類的各種病毒性疾病嚴(yán)重危害著犬類的健康和生存，也影響著我國養(yǎng)犬業(yè)的發(fā)展。為防止不同原因造成的免疫程序失敗，犬類病毒病的預(yù)防和治療顯得尤為重要。因此，臨床上迫切需要安全、有效、副作用少的干擾素制劑。

干擾素（IFN）是一類能誘導(dǎo)動物細(xì)胞產(chǎn)生多種廣譜抗病毒蛋白的細(xì)胞因子，具有阻止病毒繁殖、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)的生物學(xué)功能，是當(dāng)今應(yīng)用前景最為廣闊的重要生物制劑之一[1，2]。IFN按其細(xì)胞來源可分為α、β及γ3種類型。其中，IFN-α是由能在脊椎動物各種類型的細(xì)胞中增殖的病毒誘導(dǎo)白細(xì)胞產(chǎn)生的，主要活性是抗病毒[3-5]。因此，本試驗采用犬的肝臟組織擴(kuò)增干擾素基因，并進(jìn)一步篩選出高效表達(dá)干擾素蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)，為犬α-干擾素的體外大量表達(dá)提供了依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 試驗材料

1.1.1 動物組織、菌種及質(zhì)粒

犬肝臟由齊齊哈爾市警犬基地提供；pBV220載體由本實驗室保存；大腸桿菌E. coli DH5α、BL21、Rosetta由本研究室制備保存。

1.1.2 主要試劑

PremixTaq DNA聚合酶；DNA makerDL2000；T4 DNA連接酶；限制性內(nèi)切酶EcoRI、SalI等購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖匈徸栽金ㄌ旖颍┥锛夹g(shù)有限公司。

1.2 引物設(shè)計與合成

參照GenBank中發(fā)表的犬α-干擾素基因（EF990625）去掉信號肽后設(shè)計1對引物，引入EcoRI、SalI酶切位點。引物由上海生物工程有限公司合成，序列如下：上游引物序列：5-'ATAGAATTCAGACCTGCCCGACGCC-3’，下游引物序列：5-'TACGTCGAC TCATTTCCT CCTCCTGATTCT -3 ‘

1.3 試驗方法

1.3.1 犬肝臟組織基因組的提取

將肝臟研磨成勻漿，用滅菌生理鹽水稀釋。參照V-gene DNA提取試劑盒說明書方法提取肝組織DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 犬肝臟細(xì)胞基因的擴(kuò)增

以提取的肝組織DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在50μL PCR擴(kuò)增體系中加入PremixTaq酶2μL、上游引物1μL、下游引物1μL、DNA模板10μL、補(bǔ)去離子水36μL，混勻瞬時離心后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min后進(jìn)入PCR循環(huán)，94℃變性1min，56℃退火1min20s，72℃延伸2min，30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。0.8%瓊脂糖膠凝電泳觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果。

1.3.3 犬α-干擾素基因的克隆及轉(zhuǎn)化

參照DNA凝膠回收試劑盒說明書，回收特異的DNA條帶。將回收純化的PCR產(chǎn)物與pBV220載體分別經(jīng)酶切后進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化DH-5α、BL21、Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)12～16 h。挑取單個菌落接種含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)12～16 h。用質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖刑崛≈亟M質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒用PCR和EcoRⅠ、SalI進(jìn)行酶切及測序鑒定，確定為犬α-干擾素基因序列。

1.3.4 犬α-干擾素蛋白表達(dá)及條件優(yōu)化

1.3.4.1 干擾素-α蛋白的原核表達(dá)

挑取單個菌落接種于含50μg/mLAmp+的LB液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)過夜。同時，設(shè)置未連接目的基因的空載體轉(zhuǎn)化的DH-5α、BL21、Rosetta作為對照組。取上述過夜培養(yǎng)物以1%的比例接種于新鮮含50μg/mL Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)2～3 h，當(dāng)OD600至0.4～0.6時，放到42℃恒溫水浴中熱激并繼續(xù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)。

1.3.4.2 干擾素-α蛋白的原核表達(dá)條件優(yōu)化

表達(dá)時間優(yōu)化：將DH-5α、BL21、Rosetta 3種含pBV220-CaIFN-α的陽性工程菌以1‰量分別接入液體LB培養(yǎng)基中，30℃振蕩過夜，以1%量接入液體LB培養(yǎng)基中30℃繼續(xù)培養(yǎng)3～4 h，當(dāng)OD600約等于0.4-0.6 時，快速變溫至42℃，誘導(dǎo)表達(dá)6 h。誘導(dǎo)后每小時分別留取樣品。同時設(shè)誘導(dǎo)前和空載體對照組。根據(jù)誘導(dǎo)時間的不同確定各宿主菌的最佳表達(dá)時間。

宿主菌優(yōu)化：取DH-5α、BL21、Rosetta 3種宿主菌最優(yōu)表達(dá)時間做SDS-PAGE，并比較各宿主菌的表達(dá)量，確定最佳宿主菌。

通過誘導(dǎo)時間及表達(dá)宿主菌的不同，確定最佳表達(dá)條件。采用SDS-PAGE 電泳鑒定表達(dá)產(chǎn)物。

2 結(jié)果

2.1 犬α-干擾素基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定結(jié)果

犬α-干擾素基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，在約520 bp處可見特異性DNA條帶，大小與預(yù)期相符（如圖1所示）。

2.2 陽性重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果

取陽性重組質(zhì)粒pBV220-CaIFN-α分別用PCR鑒定，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ進(jìn)行單雙酶切鑒定，雙酶切獲得2個片斷，分別為約3 660 bp的載體片斷和約520 bp的CaIFN-α基因。用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ進(jìn)行單酶切，獲得約4 200 bp片斷，結(jié)果與預(yù)期帶大小相符（如圖2所示）。

2.3 干擾素-α基因的測序結(jié)果

干擾素-α基因的測序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符。推導(dǎo)氨基酸序列，通過在線軟件分析，試驗獲得的犬干擾素-α基因與天然犬干擾素-α的同源性為99.9%。

2.4 干擾素-α的表達(dá)及條件優(yōu)化

2.4.1 誘導(dǎo)時間的優(yōu)化結(jié)果

條件相同時，在相同宿主菌中，由于誘導(dǎo)時間的不同蛋白表達(dá)量也存在差異，因此本試驗比較了在相同宿主菌中誘導(dǎo)時間的長短對蛋白表達(dá)量的影響（結(jié)果如圖3-1、3-2、3-3所示）。Rosetta -pBV220-CaIFN-α誘導(dǎo)后1～6 h表達(dá)量分別為：1 h 11%、2 h 16%、3 h 17%、4 h 29%、5 h 18% 6 h 24%，蛋白在Rossta宿主菌中4 h表達(dá)量最高，表達(dá)量約為29%；BL21-pBV220-CaIFN-α誘導(dǎo)后1～6 h表達(dá)量分別為：1 h 11%、2 h 14%、3 h 16%、4 h 22%、5 h 27%、6 h 21%，蛋白在BL21宿主菌中5 h表達(dá)量最高，表達(dá)量約為27%；DH5α- pBV220-CaIFN-α誘導(dǎo)后1～6 h表達(dá)量分別為：1 h 9%、2 h 16%、3 h 19%、4 h 32%、5 h 23%、6 h 15%，蛋白在DH5α宿主菌中4 h表達(dá)量最高，表達(dá)量約為32%。

2.4.2 宿主菌的優(yōu)化結(jié)果

對于不同的宿主菌，蛋白的表達(dá)量也存在差異，因此本試驗具體比較了3種宿主菌對蛋白表達(dá)量的影響（如圖4-1所示）。圖中顯示，蛋白在DH-5α宿主菌中表達(dá)量最高，為32%左右。在相同條件下，同一宿主菌中，誘導(dǎo)時間的不同蛋白表達(dá)量也存在差異。根據(jù)誘導(dǎo)時間，宿主菌的不同確定出最佳誘導(dǎo)時間為4 h，最佳宿主菌為DH-5α。

3 討論

對于犬病毒病的預(yù)防，目前國內(nèi)主要采用注射犬五聯(lián)弱毒疫苗，但由于母源抗體的干擾及毒株的抗原漂移，常導(dǎo)致免疫失敗，因此研制安全高效的干擾素抗病毒制劑具有重大意義。由于犬α-干擾素屬于Ⅰ型干擾素，由不含內(nèi)含子的多拷貝基因編碼，因此本研究直接以犬肝基因組DNA為模板克隆出了犬α-干擾素基因，省去了從白細(xì)胞中提取mRNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增的繁冗。由于大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清楚、目標(biāo)基因表達(dá)水平高、培養(yǎng)周期短、抗污染能力強(qiáng)等特點[6]，因此試驗中選擇DH-5α、BL21、Rosetta 3種宿主菌作為試驗對象，確定了表達(dá)蛋白的最佳時間和高效表達(dá)的宿主菌，為表達(dá)產(chǎn)物的純化提供前提。研究結(jié)果表明，本試驗構(gòu)建的工程菌在DH-5α宿主菌中4 h時表達(dá)量最高，為進(jìn)一步探討犬α-干擾素蛋白的生物學(xué)特性、研制新型犬α-干擾素制劑，對我國犬α-干擾素生物制劑的生產(chǎn)、犬類病毒病的防治奠定了基礎(chǔ)。

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