齊碧如 江忠清 連成瑛 黃勉 林岷 劉兆董 方嬌寧

埃茲蛋白(ezrin)是ezrin-radixin-moesin(ERM)家族的成員之一，1981年首先作為表皮生長因子受體蛋白酪氨酸激酶的底物被發(fā)現(xiàn)，之后從雞小腸微絨毛中提取鑒定［1］。ezrin作為膜細(xì)胞骨架連接蛋白，主要參與上皮細(xì)胞中細(xì)胞骨架與細(xì)胞膜之間的連接，介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，對(duì)維持細(xì)胞形態(tài)、分化、運(yùn)動(dòng)性、細(xì)胞與細(xì)胞以及細(xì)胞與間質(zhì)之間的的黏附有重要調(diào)節(jié)作用，并參與多種疾病的發(fā)病過程，影響腫瘤的分化、侵襲性和轉(zhuǎn)移［2］。研究表明ezrin過度表達(dá)與不同來源的多種人體腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)，可促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移［3］。ezrin與宮頸鱗癌關(guān)系的研究國內(nèi)少見報(bào)道。本研究采用免疫組化SP法和圖像分析技術(shù)檢測(cè)ezrin在宮頸鱗癌組織的表達(dá)情況，探討其表達(dá)與局部腫瘤微血管微淋巴管生成、癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 選自1998年3月26日至2005年6月21日在福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)治療的36例宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasm，CIN)和68例宮頸鱗狀細(xì)胞癌(squamous carcinoma of cervix，SCC)患者作為研究對(duì)象。所有研究對(duì)象術(shù)前均未經(jīng)過化療、放療及免疫治療，并均經(jīng)病理確診。選取28例因功血或子宮肌瘤行子宮切除術(shù)的正常宮頸上皮(normal cervical epithelium，NCE)作為對(duì)照。CIN分級(jí)及宮頸癌組織學(xué)分級(jí)和FIGO分期參照文獻(xiàn)［4］。68例宮頸鱗癌患者年齡24～72歲，中位年齡45歲，＜45歲者30例，≥45歲者38例。CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)分別為12、11和13例。鱗癌FIGO分期Ⅰ期32例，Ⅱ期36例;組織學(xué)分級(jí)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)分別2、19和47例;脈管浸潤34例，盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例;鏡下早期浸潤癌5例，明顯間質(zhì)浸潤癌63例(淺、深肌層浸潤各15和48例)。從手術(shù)當(dāng)日到2006年12月31日止，對(duì)本組68例宮頸鱗癌患者進(jìn)行隨訪，共隨訪到53例，隨訪率77.94%，隨訪時(shí)間5～93個(gè)月，平均54.8個(gè)月。在隨訪到的53例中死亡14例，3年生存率74.51%(38/51)，5年生存率67.44%(29/43)。

1.2 試劑 鼠抗人ezrin單克隆抗體(克隆號(hào)3 c12)、鼠抗人CD34單克隆抗體(克隆號(hào)QBEND/10)、鼠抗人MIB1單克隆抗體(克隆號(hào) MIB1)、即用型 UltraSensitiveTMSP超敏試劑盒(Cat.No:KIT-9710)及DAB染色劑等購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。濃縮型兔抗人VEGFR-3多克隆抗體(產(chǎn)品編號(hào)ZA-0267，工作濃度1∶100)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法 所有新鮮標(biāo)本均經(jīng)4%甲醛溶液固定，48 h內(nèi)取材，石蠟包埋，連續(xù)3～5 μm厚度切片。采用免疫組化SP法檢測(cè)CIN和宮頸鱗癌組織中ezrin、CD34、VEGFR3和MIB1的表達(dá)情況。具體步驟按說明書進(jìn)行。ezrin、CD34、VEGFR3和MIB1均采用檸檬酸緩沖液高壓熱力修復(fù)抗原，DAB顯色。ezrin未進(jìn)行蘇木素復(fù)染，CD34、VEGFR3和MIB1進(jìn)行蘇木素復(fù)染。用已知陽性片作為陽性對(duì)照，用PBS代替第一抗體作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷 ezrin表達(dá)水平測(cè)定:ezrin在細(xì)胞漿和(或)細(xì)胞膜表達(dá)，陽性染色者在細(xì)胞漿和(或)細(xì)胞膜被染色呈棕黃色。用JD801圖像分析系統(tǒng)測(cè)定每張切片9個(gè)200倍視野ezrin陽性染色區(qū)的灰度值和光密度值，以平均光密度值的大小來表示ezrin表達(dá)水平的高低。CD34標(biāo)記的微血管密度(microvessel density，MVD):CD34表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色染色，其判斷標(biāo)準(zhǔn)及脈管浸潤的判斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)［5］。VEGFR3標(biāo)記的微淋巴管密度(lymphatic microvessel density，LMVD):VEGFR-3陽性染色主要位于腫瘤邊緣及間質(zhì)微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色染色，可見微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞圍成壁薄、形態(tài)不規(guī)則的管腔結(jié)構(gòu)，內(nèi)無紅細(xì)胞。LMVD判斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)［6］。MIB1標(biāo)記的增殖指數(shù)(proliferation index，PI):MIB1在細(xì)胞核表達(dá)，陽性染色者細(xì)胞核呈棕黃色。在光鏡下隨機(jī)觀察具有代表性的10個(gè)高倍視野(400)，每個(gè)視野記數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，計(jì)算其陽性標(biāo)記細(xì)胞數(shù)即為PI。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，定量資料比較采用方差分析及t檢驗(yàn)，變量間的關(guān)系采用直線相關(guān)分析，生存情況采用Kaplan-Meier曲線表示，Log rank檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ezrin在NCE、CIN及SCC組的表達(dá) 從NCE到CIN再到SCC組，ezrin表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05)。ezrin在NCE組主要表達(dá)于上皮細(xì)胞膜，在CIN組主要表達(dá)于異型細(xì)胞質(zhì)，在SCC組主要彌漫性表達(dá)于癌細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜。ezrin在CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ的表達(dá)水平分別為(0.0819±0.0153)、(0.0933±0.0107)、(0.1018±0.0159)。ezrin在 CINⅢ的表達(dá)水平顯著高于CINⅠ(SNK方差分析:CINⅢvs CINⅠ，P＜0.05)。ezrin在 NCE、CIN及 SCC組的表達(dá)見圖 1A、1B及1C。

表1 ezrin在NCE、CIN及SCC組的表達(dá)(±s)

表1 ezrin在NCE、CIN及SCC組的表達(dá)(±s)

注:Dunnett`s T3方差分析:a指NCE vs CIN，P=0.012;b指CIN vs SCC，P=0.000;c指 SCC vs NCE，P=0.000

圖1 ezrin在NCE、CIN及SCC組表達(dá)

2.2 ezrin在CIN及SCC組的表達(dá)分別與MVD、LMVD及PI的關(guān)系 在NCE、CIN及SCC組，CD34標(biāo)記的MVD分別為(6.3±2.9)、(18.0±4.7)及(58.2±19.6)條;VEGFR-3標(biāo)記的LMVD分別為(2.24±3.8)、(6.37±5.7)和(8.3±2.8)條;Ki-67標(biāo)記的 PI分別為(96.0±54.6)、(300.0±157.1)及(378.7 ±199.6)。從NCE到CIN再到SCC組，MVD、LMVD及PI均顯著升高(MVD 組:CIN vs NCE，P=0.000，SCC vs CIN，P=0.000，SCC vs NCE，P=0.000;LMVD 組:CIN vs NCE，P=0.003，SCC vs CIN，P=0.176，SCC vs NCE，P=0.000;PI組:CIN vs NCE，P=0.000，SCC vs CIN，P=0.043，SCC vs NCE，P=0.000)。將ezrin在CIN及SCC組的表達(dá)均以中位值為界分為高和低表達(dá)兩組。在CIN及SCC組，ezrin高表達(dá)組MVD、LMVD及PI分別與低表達(dá)組相比均無顯著性差異(P＞0.05)。Pearson相關(guān)分析顯示，ezrin在CIN和SCC組表達(dá)均分別與MVD(CIN組:r=0.059，P=0.735;SCC組:r=0.148，P=0.233)、LMVD(CIN 組:r=0.173，P=0.314;SCC組:r=0.230，P=0.059)及 PI(CIN 組:r=0.160，P=0.359:SCC 組:r=-0.067，P=0.589)無關(guān)。CD34、VEGFR3和Ki-67在SCC組表達(dá)分別見圖2A、2B和2D。

表2 ezrin在CIN和SCC組表達(dá)分別與MVD、LMVD及PI的關(guān)系

2.3 ezrin在SCC組的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 ezrin在SCC組表達(dá)與FIGO分期、浸潤深度、有否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及脈管浸潤密切相關(guān)(P＜0.05)。FIGO分期為Ⅱ期、有盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、突破深肌層間質(zhì)浸潤及有脈管浸潤者，其ezrin表達(dá)顯著高于FIGO分期為Ⅰ期、無盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度在淺肌層間質(zhì)以內(nèi)及無脈管浸潤者(P＜0.05)(表3)。

表3 ezrin 在SCC組的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(±s)

表3 ezrin 在SCC組的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(±s)

2.4 ezrin在SCC組的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 將ezrin在SCC組的表達(dá)以中位數(shù)為界分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，兩組Kaplan-Meier生存曲線見圖3。ezrin高表達(dá)組患者的生存率明顯低于低表達(dá)組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(log rank檢驗(yàn)，P=0.0631)。

圖2 CD34、VEGFR3和MIB-1在宮頸鱗癌的表達(dá)

圖3 ezrin高表達(dá)組和低表達(dá)組宮頸鱗癌患者Kaplan-Meier生存曲線

3 討論

ezrin是一個(gè)分子量為82KDa的磷酸化蛋白，由585個(gè)氨基酸組成，其編碼基因?yàn)閂illin2(Vil2)，定位于6q25.2-6q26。ezrin蛋白N-端與細(xì)胞膜結(jié)合，C-端與F-肌動(dòng)蛋白連接，參與亞細(xì)胞骨架構(gòu)建和接觸識(shí)別，維持細(xì)胞膜表面的一些特殊結(jié)構(gòu)如微絨毛、絲狀假足、尾足等，在細(xì)胞形態(tài)調(diào)節(jié)和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮重要作用，此外還將膜蛋白如CD44、E-Cadherin等與F-肌動(dòng)蛋白連接起來［2］。ezrin與膜表面受體分子、粘附分子相互作用，參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，將各種細(xì)胞膜外信號(hào)通過ezrin與膜整合蛋白直接連接而傳入細(xì)胞內(nèi)［2］。ezrin參與的這些細(xì)胞活動(dòng)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，可能是腫瘤轉(zhuǎn)移的核心蛋白。ezrin與宮頸癌進(jìn)展及預(yù)后的研究國內(nèi)外少見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，從NCE到CIN再到SCC組，ezrin表達(dá)水平顯著增強(qiáng)(P＜0.05)。在CIN中，ezrin在CINⅢ的表達(dá)水平顯著高于CINⅠ(P＜0.05)。提示宮頸上皮細(xì)胞從受損到癌變，ezrin蛋白合成增加。ezrin與腫瘤細(xì)胞表面黏附分子CD44及其變異體形成復(fù)合物，在腫瘤細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移中有共同表達(dá)現(xiàn)象，并參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程。CD44過度表達(dá)可引起膜-細(xì)胞骨架連接蛋白-ezrin的功能激活［1］。E-cadherin能反向調(diào)節(jié)CD44活性而抑制其介導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移。E-cadherin丟失或調(diào)節(jié)功能降低將破壞其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。ezrin在E-cadherin的膜定位上起著重要作用，ezrin激活或過度表達(dá)使E-cadherin在胞內(nèi)蓄積而在細(xì)胞表面表達(dá)減少，使E-cadherin被隔離在細(xì)胞內(nèi)，從而導(dǎo)致細(xì)胞與細(xì)胞間連接破壞［7］?？梢?，ezrin過度表達(dá)可能導(dǎo)致E-cadherin功能缺失，后者對(duì)CD44的降調(diào)作用解除而使CD44表達(dá)升高，最終引起E-cadherin與CD44功能失衡，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的增強(qiáng)。故筆者認(rèn)為，宮頸鱗癌ezrin過度表達(dá)可能在其發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。Ohtani等［8］報(bào)道，ezrin在正常子宮內(nèi)膜和增殖癥子宮內(nèi)膜細(xì)胞中僅表達(dá)于細(xì)胞膜，而在非典型增生子宮內(nèi)膜細(xì)胞及子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中表達(dá)于細(xì)胞漿，認(rèn)為ezrin不同著色部位對(duì)子宮內(nèi)膜癌病變的性質(zhì)具有標(biāo)識(shí)作用。本研究結(jié)果也顯示，ezrin在NCE、CIN和SCC細(xì)胞中定位不同，ezrin在NCE組幾乎表達(dá)于細(xì)胞膜上，而在CIN和SCC組異型或癌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈彌漫性表達(dá)。上述研究提示，隨宮頸上皮惡性轉(zhuǎn)化的發(fā)生，ezrin蛋白表達(dá)上調(diào)并出現(xiàn)表達(dá)定位改變。可見，ezrin蛋白的表達(dá)改變可能與宮頸上皮惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，但有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

Zhang等［9］發(fā)現(xiàn)，ezrin蛋白過表達(dá)與肝細(xì)胞癌增殖、侵襲和遷移正相關(guān)，下調(diào)其表達(dá)可抑制高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞系侵襲力。張肖肖等［10］研究發(fā)現(xiàn)，ezrin蛋白在胃癌組織中高表達(dá)，并與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)。Shen等［11］研究發(fā)現(xiàn)，高侵襲性人食管癌細(xì)胞株ezrin表達(dá)顯著高于對(duì)照組，且高表達(dá)ezrin的SHEEMT細(xì)胞在體內(nèi)更易于侵犯軟組織、系膜和胰腺而表現(xiàn)更高的侵襲特性。Khanna等［12］發(fā)現(xiàn)高轉(zhuǎn)移能力的小兒骨肉瘤細(xì)胞株K7 m2 ezrin表達(dá)量是低轉(zhuǎn)移能力的K12的3倍，高轉(zhuǎn)移能力的K7 m2細(xì)胞轉(zhuǎn)染反義RNA抑制ezrin表達(dá)，能顯著阻止肺部轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)染ezrin-T567A(相當(dāng)于失活ezrin)后，肺部轉(zhuǎn)移則完全被阻止。可見，ezrin不但足以導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移，而且對(duì)于腫瘤轉(zhuǎn)移是必不可少的。本研究結(jié)果顯示，ezrin在SCC組表達(dá)與FIGO分期、浸潤深度、有否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及脈管浸潤密切相關(guān)(P≤0.05)。FIGO分期為Ⅱ期、有盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、突破深肌層間質(zhì)浸潤及有脈管浸潤者，其ezrin表達(dá)顯著高于FIGO分期為Ⅰ期、無盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度在淺肌層間質(zhì)以內(nèi)及無脈管浸潤者(P≤0.05)。隨FIGO分期增加、間質(zhì)浸潤加深、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管浸潤的發(fā)生，宮頸鱗癌組織ezrin表達(dá)水平顯著升高。張艷廷等［13］報(bào)道，ezrin和CD44V6在喉鱗癌中表達(dá)升高與組織學(xué)分級(jí)、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，聯(lián)合檢測(cè) ezrin和CD44V6表達(dá)有助于綜合判斷喉鱗癌的惡性度和轉(zhuǎn)移潛能。Ohtani等［14］研究發(fā)現(xiàn)，ezrin在高轉(zhuǎn)移能力的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系mEⅡL表達(dá)顯著高于低轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞系Ishikawa，過度表達(dá)ezrin的腫瘤細(xì)胞穿透基底膜的能力增強(qiáng)，而抑制ezrin表達(dá)后的兩種細(xì)胞系的侵襲能力均下降，穿透基質(zhì)膜的瘤細(xì)胞數(shù)量均明顯減少，但ezrin表達(dá)對(duì)癌細(xì)胞增殖沒有影響。Chuan等［15］研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌細(xì)胞珠LNCaP-FGC采用siRNA抑制或采用過表達(dá)T567A和Y353F-ezrin突變體干擾ezrin表達(dá)活性，能顯著降低癌細(xì)胞穿透基質(zhì)膜的能力，但不影響癌細(xì)胞的增殖能力。本文研究結(jié)果顯示，宮頸鱗癌ezrin表達(dá)與癌細(xì)胞增殖指數(shù)沒有顯著相關(guān)性(r=-0.067，P=0.589)，與 Ohtani等［14］和 Chuan 等［15］的結(jié)果一致。ezrin 與腫瘤新生血管生成關(guān)系的研究國內(nèi)外少見報(bào)道。有學(xué)者報(bào)道，Ezrin能抑制內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)增和血管生成［16］。筆者發(fā)現(xiàn)宮頸鱗癌組織ezrin表達(dá)與微血管密度無顯著相關(guān)性(r=0.148，P=0.233)。ezrin與腫瘤新生淋巴管生成關(guān)系的研究國內(nèi)外未見報(bào)道。筆者結(jié)果顯示，宮頸鱗癌組織ezrin表達(dá)與微淋巴管密度無顯著相關(guān)性(r=0.230，P=0.059)。故筆者認(rèn)為，ezrin在CIN中表達(dá)增強(qiáng)提示癌細(xì)胞易于突破基底膜向間質(zhì)浸潤，ezrin在SCC中過度表達(dá)顯示癌細(xì)胞向深部浸潤的同時(shí)進(jìn)而突破脈管基底膜浸潤淋巴管和血管，最終發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。在宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中，ezrin可能不直接參與癌細(xì)胞增殖和新生血管淋巴管形成的調(diào)節(jié)，而直接參與增強(qiáng)癌細(xì)胞穿透基底膜，致使腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。

文獻(xiàn)報(bào)道，多種人體惡性腫瘤ezrin表達(dá)上調(diào)與患者預(yù)后密切相關(guān)，ezrin過度表達(dá)生存期短、預(yù)后差［17-20］。但也有研究認(rèn)為，惡性腫瘤ezrin表達(dá)下調(diào)者預(yù)后差。Moilanen等［21］報(bào)道，漿液性卵巢癌ezrin蛋白表達(dá)下調(diào)者預(yù)后差。絨毛膜癌ezrin蛋白表達(dá)降低后侵襲力反而增強(qiáng)［22］。筆者資料可以看出，ezrin高表達(dá)組患者的生存率明顯低于低表達(dá)組，但未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(log rank檢驗(yàn)，P=0.0631)。故筆者認(rèn)為，ezrin表達(dá)可能具有組織和器官的特異性，其表達(dá)水平并非完全與腫瘤轉(zhuǎn)移及預(yù)后平行，其在腫瘤轉(zhuǎn)移中的復(fù)雜作用有待進(jìn)一步研究探討。

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