曾雪峰，夏文水

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

我國的淡水魚產(chǎn)量高居世界首位，但由于淡水魚的含水量大、土腥味重、不易貯藏的原料特性及淡水魚制品加工中關(guān)鍵技術(shù)的缺失等原因，致使目前淡水魚的加工量還不足淡水魚養(yǎng)殖產(chǎn)量的15%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后歐美日等發(fā)達國家的水平。應(yīng)用生物發(fā)酵方法來保持和改善肉類制品的品質(zhì)或抑制腐敗菌的生長是一種很好的食品加工保藏方法［1］。湘西傳統(tǒng)酸魚是我國湖南湘西地區(qū)一種傳統(tǒng)淡水全魚發(fā)酵制品，產(chǎn)品具有酸辣適口、回甜咸鮮、香氣獨特、回味醇厚、保質(zhì)期長等特點。是一種高蛋白、低脂肪、生物胺含量低、富含多種游離氨基酸的功能性食品。但湘西傳統(tǒng)發(fā)酵全魚制品大多是手工作坊式生產(chǎn)，自然發(fā)酵微生物種類的安全性難以保障，生產(chǎn)周期長，質(zhì)量不穩(wěn)定，安全性差，工業(yè)化程度低。

湘西傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中棲息著種類繁多、數(shù)量豐富的微生物，主要是乳酸菌［2］。麻成金等人對湘西傳統(tǒng)酸肉的優(yōu)勢乳酸菌進行了分離篩選，選育出具有產(chǎn)酸快、發(fā)酵特性好、符合產(chǎn)業(yè)化要求性狀的米酒乳桿菌作為發(fā)酵劑［2］。而迄今為止，對湘西酸魚中乳酸菌的菌種特性尚無相關(guān)報道?？疾檫@種傳統(tǒng)美食中存在的乳酸菌菌株特性，對研究湘西傳統(tǒng)酸魚的風(fēng)味、質(zhì)構(gòu)、色澤及貯藏性具有相當(dāng)?shù)睦碚撝笇?dǎo)意義，對改進我國淡水全魚發(fā)酵制品傳統(tǒng)發(fā)酵工藝、實現(xiàn)其工業(yè)化生產(chǎn)具有重要現(xiàn)實意義。本研究從湘西傳統(tǒng)淡水全魚發(fā)酵制品中分離的196株乳酸菌株進行了菌群分布分析、產(chǎn)酸速率、耐鹽耐硝酸鹽、抑菌性、氨基酸脫羧酶活性等試驗，以期得到適合工業(yè)化生產(chǎn)發(fā)酵魚制品的優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株篩選樣品

本課題分別選取湘西鳳凰、花垣兩種優(yōu)質(zhì)傳統(tǒng)低鹽發(fā)酵酸魚作為菌株分離樣品。其中鳳凰低鹽酸魚標(biāo)為XXF;花垣低鹽酸魚標(biāo)為XXH。

1.1.2 實驗材料

蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、瓊脂、酵母膏、溴甲酚紫、精氨酸、半胱氨酸等為BR級。

乙酸鈉、NaCl、檸檬酸二銨、KH2PO4、MnSO4、Mg-SO4、NaOH、HCl、醋酸鉛、Na2SO3、CaCO3等試劑均為AR級。

1.1.3 實驗儀器與設(shè)備

相差顯微鏡(XSS-2);潔凈工作臺(HS-1300);電蒸恒溫培養(yǎng)箱(XMT-152A);紫外可見分光光度計(WFZ UV-2100);電子天平(FA 1104);手提式壓力蒸汽滅菌鍋(YQX-LS-18SI)。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基［3］

MRS培養(yǎng)基、硝酸鹽還原試驗培養(yǎng)基、精氨酸產(chǎn)氨培養(yǎng)基、葡萄糖產(chǎn)氣培養(yǎng)基、產(chǎn)H2S培養(yǎng)基、產(chǎn)H2O2檢測用培養(yǎng)基、明膠液化培養(yǎng)基、淀粉水解培養(yǎng)基、產(chǎn)黏液培養(yǎng)基、醋酸鹽瓊脂培養(yǎng)基。

1.2.2 酸魚制作方法

依照湘西傳統(tǒng)酸魚制作工藝方法，稱取體重100～150 g的新鮮鯉魚，經(jīng)去鱗、取鰓、除內(nèi)臟，清水洗凈，并根據(jù)當(dāng)?shù)叵M者的喜好，按一定比例添加食鹽和各種香辛料，混合均勻后置冰箱中腌制24 h后，曬制2 d，以除去部分水分，然后與適量谷類化合物混勻，并在魚肚中塞入部分谷類化合物，陶瓷壇的底部鋪上部分碳水化合物作為底料，層魚層輔料，壓緊，頂部鋪上一層輔料后鋪上一層朔料，加蓋封嚴(yán)。自然溫度發(fā)酵成熟。XXF和XXH的具體生產(chǎn)工藝及配方詳見表1。不同生產(chǎn)階段(0，10，20，30，40 d)的酸魚樣品被分別收集置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 湘西傳統(tǒng)發(fā)酵酸魚工藝條件

1.2.3 乳酸菌的分離鑒定

無菌操作，分別準(zhǔn)確稱量25 g XXF、XXH，絞碎后各自加225 g的無菌生理鹽水，振蕩搖勻后梯度稀釋至適宜濃度，無菌移取0.1 mL稀釋樣液，均勻涂布到D 9 cm固體MRS培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48 h后挑取可疑乳酸菌菌株反復(fù)劃線培養(yǎng)，獲得純菌株。并對分離純化菌株的菌落形態(tài)、革蘭氏染色、葡萄糖產(chǎn)酸試驗及過氧化氫酶試驗進行初步菌株特性鑒定。其中革蘭氏陽性和過氧化氫酶陰性的菌株被保存在－18℃，含30%甘油的液體MRS培養(yǎng)液中。采用APICHL50系統(tǒng)對分離的菌株鑒定到種。

1.2.4 生理生化實驗［3］

經(jīng)分離的乳酸菌，通過葡萄糖產(chǎn)氣試驗、硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗、淀粉水解試驗、運動性試驗、產(chǎn)硫化氫試驗、醋酸鹽試驗、產(chǎn)黏性試驗、精氨酸產(chǎn)氨試驗、溫度試驗對其菌株特性進行分析。

1.2.5 產(chǎn)酸速率實驗［4］

將分離得到的不同乳酸菌株接種到MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，同時以未接種的MRS液體培養(yǎng)基作空白對照，30℃培養(yǎng)0，4，8，12，16，20和24 h后分別測定其pH值。

1.2.6 耐鹽性實驗、耐亞硝鹽實驗［4］

將活化后待測乳酸菌株以1%(V/V)接種至含有 4%、6%、10%的 NaCl濃度，50 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg的NaNO2濃度液體MRS培養(yǎng)基中，分別在30℃厭氧培養(yǎng)36 h和24 h，同時做空白對照，于λ=600 nm處測定其OD值。

1.2.7 耐酸和膽鹽實驗［5］

將分離的菌株30℃過夜培養(yǎng)活化，取0.5 mL的細(xì)菌培養(yǎng)液接種于10 mL的磷酸鹽緩沖液中，用5 mol/L HCl分別調(diào) pH 值至2.5、3.9、9.6，初始菌液濃度調(diào)為106～108CFU/mL，置于37℃培養(yǎng)3 h。取2 mL活化菌液分別接種于8 mL含0.1%、0.2%和0.3% 膽鹽的MRS培養(yǎng)液中培養(yǎng)4 h后測定活菌數(shù)。存活菌數(shù)采用平板活菌數(shù)計數(shù)法，計算其活菌數(shù)。菌株的存活率為MRS瓊脂平板測得的活菌數(shù)與初始菌數(shù)的百分比。

1.2.8 抑菌性實驗［4］

取經(jīng)上述試驗的分離菌株活化后，在MRS液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)48 h，離心取發(fā)酵上清液。選用大腸桿菌、李斯特桿菌和金黃色葡萄球菌作為指示菌，分別取0.1 mL經(jīng)活化12 h的大腸桿菌、李斯特桿菌和金黃色葡萄球菌菌液涂布于基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，在指示菌平板上間隔打孔，分別在每個孔內(nèi)滴加200 μL乳酸菌發(fā)酵上清液，30℃培養(yǎng)24 h后測量各待測菌株抑菌圈的大小。

1.2.9 氨基酸脫羧酶實驗

將活化后的待測菌株分別按1%(V/V)接入添加有1%(m/V)組氨酸、酪氨酸、賴氨酸及鳥氨酸的含0.06%溴甲酚紫作為指示劑的MRS培養(yǎng)液中，30℃厭氧培養(yǎng)7天后觀察培養(yǎng)液顏色變化，顏色由黃變紫表示菌株氨基酸脫羧酶活性陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離鑒定

從湘西傳統(tǒng)發(fā)酵酸魚中共分離出201株菌株，其中革蘭氏陽性菌、葡萄糖產(chǎn)酸和過氧化氫酶陰性菌株196株。XXF中分離出96株，XXH分離出100株。分離出的菌株菌落光滑整齊、短桿或球狀、白色、透明或不透明、菌落呈圓形、表面濕潤光滑、邊緣整齊、形態(tài)微小、菌落直徑在1.0～2.0 mm之間，201株疑似乳酸菌株中有98株革蘭氏陽性球菌、98株革蘭氏陽性桿菌、1株革蘭氏陰性球菌、4株革蘭氏陰性桿菌、桿菌呈短桿狀，兩端平直或稍彎曲，無芽孢，無鞭毛，球菌多呈單個分布。

API鑒定結(jié)果表明湘西傳統(tǒng)酸魚中分離的196株乳酸菌種類及含量分別是:植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)(32.1%)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)(28.1%)是主要的乳酸菌菌株，接著是明串珠菌(Leuconostoc)(21.9%)、食品乳桿菌(Lactobacillus alimentarius)(14.3%)，以及零星的腸球菌(Enterococcus durans)和干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)。由表2可知，戊糖片球菌和植物乳桿菌是發(fā)酵過程中的第一優(yōu)勢菌，而明串珠菌在發(fā)酵的初始階段占據(jù)優(yōu)勢，在發(fā)酵后期已不再有明串珠菌檢出，食品乳桿菌在發(fā)酵中后期保持穩(wěn)定。明串珠菌在發(fā)酵起始階段好氧發(fā)酵產(chǎn)酸，抑制了好氧菌、不耐酸及其它微生物的生長，隨著發(fā)酵時間的延長和pH值的降低，耐酸的植物乳桿菌和戊糖片球菌成為了酸魚的主要優(yōu)勢菌群，從而授予產(chǎn)品獨特的風(fēng)味和較長的保存期。

表2 湘西傳統(tǒng)發(fā)酵酸魚發(fā)酵期間乳酸菌群的消長變化

2.2 乳酸菌的生理生化實驗

將分離出的乳酸菌株進行菌種特性試驗，結(jié)果見表3:試驗結(jié)果表明所有的菌株均未產(chǎn)氣、不具有硝酸鹽還原性、無運動性、不產(chǎn)硫化氫;所有菌株均能在15℃條件下生長，部分菌株在4℃下能生長以及少部分菌株在45℃時能生長;1株(1.6%)植物乳桿菌和1株(1.8%)戊糖片球菌在蔗糖培養(yǎng)基上具有產(chǎn)黏特性;2株(3.2%)植物乳桿菌、3株(5.5%)戊糖片球菌、1株(3.6%)食品乳桿菌和1株(33.3%)腸球菌水解精氨酸產(chǎn)氨。

表3 湘西傳統(tǒng)發(fā)酵酸魚乳酸菌生理生化試驗

2.3 產(chǎn)酸速率實驗

作為產(chǎn)品優(yōu)良發(fā)酵劑乳酸菌菌株的檢測指標(biāo)之一，快速的菌株產(chǎn)酸速率能有效增強菌株的抑菌性、加速產(chǎn)品風(fēng)味的形成、提高產(chǎn)品凝膠性能及促進產(chǎn)品色澤形成等。研究結(jié)果表明:5株植物乳桿菌和3株戊糖片球菌顯示了更快的產(chǎn)酸速率(圖1和圖2所示)，在30℃，16 h和24 h內(nèi)分別使pH迅速降至4.0以下，且產(chǎn)酸速率沒有顯著差異(P≥0.05)，食品乳桿菌、明串珠菌和干酪乳桿菌的產(chǎn)酸速率明顯低于植物乳桿菌和戊糖片球菌(P≤0.05)。

圖1 5株典型乳酸菌30℃的產(chǎn)酸率

2.4 耐食鹽，耐亞硝鹽實驗

制作肉制品發(fā)酵劑所選用的菌株，根據(jù)Smith和Palumbo［7］的報道，耐受6%的食鹽和100 mg/L的亞硝鹽是作為適合肉制品發(fā)酵劑的特性之一，它們在提高產(chǎn)品貯藏性、抑制有害微生物、穩(wěn)定肉制品色澤及促進產(chǎn)品風(fēng)味形成方面發(fā)揮著重要的作用。根據(jù)比濁法原理，以菌株在MRS液體培養(yǎng)基中OD值的變化，作為微生物生長指標(biāo)，研究菌株的耐鹽和耐亞硝酸鹽特性。試驗結(jié)果如表4所示。

表4 湘西傳統(tǒng)酸魚分離的乳酸菌在耐食鹽、亞硝酸鹽濃度

由表4可得出，所有菌株均能耐受4%的食鹽濃度，68.3%植物乳桿菌、52.7%戊糖片球菌及38.5%食品乳桿菌能耐受6%的食鹽濃度，所有的菌株均不能耐受10%的食鹽濃度。85.5% 植物乳桿菌、81.1% 戊糖片球菌能耐受150 mg/mL的亞硝鹽。

2.5 耐酸及耐膽鹽實驗

發(fā)展新型功能性的發(fā)酵肉制品，要求足夠數(shù)量能耐受胃酸和膽汁環(huán)境的益生菌。因而，依據(jù)菌種特性和篩選標(biāo)準(zhǔn)，我們對傳統(tǒng)酸魚中存在的能耐受模擬胃腸道環(huán)境的乳酸菌進行了探討、分析和篩選。由表5能夠得出:41.3% 植物乳桿菌、37.6%戊糖片球菌及21.3%食品乳桿菌能耐受pH 2.5的胃酸環(huán)境2 h以上，活菌存活數(shù)量均達到106CFU/mL，而其余菌株的活菌數(shù)量大多在102－104CFU/mL，人體胃酸pH值一般在1.5～4.5之間，據(jù)此可得出，傳統(tǒng)酸魚中存在部分能耐胃酸的優(yōu)質(zhì)乳酸菌。實驗結(jié)果表明:21.7%植物乳桿菌、18.3% 戊糖片球菌及11.4% 食品乳桿菌能耐受0.3%的膽鹽4 h，活菌存活數(shù)量保持在107CFU/mL水平，其余菌株的存活數(shù)量僅有102～103CFU/mL，人體小腸中膽鹽的含量一般在0.03～0.3之間，且食物在小腸中的停留時間大多在1～4 h，由此可知:傳統(tǒng)酸魚中存有部分能耐受0.3%膽鹽的乳酸菌株。其中，5株植物乳桿菌和3株戊糖片球菌具有較好的耐受胃酸和膽鹽能力。

表5 湘西傳統(tǒng)酸魚分離的乳酸菌耐酸、膽鹽特性

2.6 抑菌性實驗

乳酸菌的大量繁殖，乳酸的酸化和菌株產(chǎn)生細(xì)菌素抑制食品腐敗菌和致病菌產(chǎn)生。因而，研究傳統(tǒng)酸魚制品優(yōu)勢乳酸菌的抑菌性試驗也為我們提供了篩選酸魚優(yōu)良發(fā)酵劑的理論和實踐依據(jù)。在分離的乳酸菌株中，82.4%植物乳桿菌、87.7% 戊糖片球菌、81.2% 食品乳桿菌、74.6% 明串珠菌和100% 干酪乳桿菌產(chǎn)生抑制大腸桿菌的抗菌物質(zhì)。92.5% 植物乳桿菌、93.2% 戊糖片球菌、88.1% 食品乳桿菌、90.3% 明串珠菌和100% 干酪乳桿菌產(chǎn)生抑制金黃色葡萄球菌和李斯特桿菌的抗菌物質(zhì)。分離的3株腸球菌均不能抑制大腸桿菌。其中，4株植物乳桿菌和3株戊糖片球菌的抑制3種指示菌株的抑菌圈都在10 mm以上(表6所示)。

表6 湘西傳統(tǒng)發(fā)酵酸魚分離的乳酸菌株抑菌性

2.7 氨基酸脫羧酶實驗

發(fā)酵肉制品中的部分乳酸菌具有氨基酸脫羧酶活性，尤其在低pH值和高水分含量的條件下，它們往往脫羧某些特定的氨基酸，生成酪胺、組胺、尸胺、腐胺及苯基乙胺。這些化合物不僅劣化了食品的風(fēng)味，而且對人體的健康會產(chǎn)生嚴(yán)重的危害。因而，研究傳統(tǒng)酸魚中的乳酸菌是否具有氨基酸脫羧酶活性，對了解酸魚的安全品質(zhì)及產(chǎn)品是否具備推廣價值具有十分重要的意義。根據(jù)表7所示:在分離的196株乳酸菌株中，僅有1株植物乳桿菌、2株 腸球菌、1株明串珠菌具有氨基酸脫羧酶活性。

表7 湘西傳統(tǒng)酸魚分離的乳酸菌氨基酸脫羧酶活性

3 結(jié)論

(1)從湘西傳統(tǒng)酸魚共中分離出196株乳酸菌，并對其進行了鑒定，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌和戊糖片球菌是主要的優(yōu)勢菌株。

(2)分別對196株乳酸菌株進行生理生化、產(chǎn)酸速率、耐鹽及亞硝酸鹽、耐酸、耐膽鹽、抑菌性、氨基酸脫羧酶及生長曲線的菌株特性研究。

(3)實驗發(fā)現(xiàn)3株植物乳桿菌(Lp-7，Lp-10，Lp-21)和1株戊糖片球菌(Pp-27)具有產(chǎn)酸速率快，耐鹽、耐酸、耐膽鹽、無氨基酸脫羧酶活性，適合開發(fā)成淡水魚發(fā)酵制品發(fā)酵劑的潛力。

［1］Hammes W P，Haller P，Ganzle M G.Fermented meat In Handbook of fermented functional foods，F(xiàn)arnworth，W R(ed)［M］.Boca Raton，F(xiàn)L:CRC Press，2003:251－275.

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