于 喆，江 輝，鐘 蕾，肖克宇，譚 情，毛 盼

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 中國 長沙 410128)

大鯢(Andriasdavideanus),也稱娃娃魚,是我國特有的珍稀有尾兩棲動物, 國家二級保護(hù)動物,其經(jīng)濟(jì)價值高,具有廣泛開發(fā)利用的前景[1]．為恢復(fù)和有效利用大鯢資源，自20世紀(jì)60年代起國內(nèi)有許多單位開始對大鯢進(jìn)行人工養(yǎng)殖研究，并取得了較好的效果．但近年來隨著養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖大鯢經(jīng)常發(fā)生各種疾病,給廣大養(yǎng)殖戶造成慘重的經(jīng)濟(jì)損失．2010年10月份,貴州松桃龍洞原生態(tài)科技發(fā)展有限公司大鯢養(yǎng)殖場發(fā)生了細(xì)菌性感染綜合癥，該病國內(nèi)雖有報道[2]，并分離鑒定病原菌為嗜水氣單胞菌，但病原種類和癥狀等多樣的原因尚有爭議.發(fā)病癥狀主要表現(xiàn)為患病大鯢頭部紅腫潰爛，腹部腫脹積有大量腹水，肝臟腫大，體表黏液部分脫落,體表和四肢有綠豆大小的白斑，隨著病情的發(fā)展,白色斑點進(jìn)一步腐爛成潰瘍狀直至暴露紅色的肌肉．患病大鯢四肢無力，食欲減退直至死亡．養(yǎng)殖者在鉺料中添加慶大霉素(Gentamicin)進(jìn)行試治，效果不顯著．筆者就此進(jìn)行相關(guān)研究，分離到3種致病菌，現(xiàn)報道如下．

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料 患病大鯢來自貴州松桃龍洞原生態(tài)科技發(fā)展有限公司大鯢養(yǎng)殖場，體重70～100 g；牛蛙來自長沙市馬王堆水產(chǎn)市場，健康正常，體重100～150 g，在水族箱內(nèi)馴養(yǎng)一周．

1.1.2 培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏 3.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂 15.0 g，加水補(bǔ)充到1 000 mL，pH 7.0．

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離 從貴州松桃龍洞原生態(tài)科技發(fā)展有限公司大鯢養(yǎng)殖場采集體長14～22 cm,體重70～100 g的瀕死大鯢4尾，解剖，用接種環(huán)在體表、肝臟、腎臟、腸道、四肢、腹水等病灶部位挑取少量組織液，分別在普通營養(yǎng)瓊脂平板上劃線接種, 于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h, 選取單個菌落接種于斜面, 再進(jìn)行平板劃線, 將分離到的細(xì)菌提純培養(yǎng)，保存至斜面?zhèn)溆茫?/p>

1.2.2 分離菌的菌落形態(tài)觀察及染色 對培養(yǎng)出的細(xì)菌菌落進(jìn)行觀察,并對其大小、形態(tài)、顏色、隆起度等特征進(jìn)行記錄．對分離純化的上述培養(yǎng)菌進(jìn)行革蘭氏染色,觀察細(xì)菌的個體形態(tài)及染色特征．

1.2.3 分離菌的生理生化特性檢查及菌種鑒定 取分離純化的上述培養(yǎng)菌, 分別進(jìn)行氧化酶、葡萄糖發(fā)酵等試驗,鑒定其生物學(xué)特征，同時進(jìn)行接觸酶、七葉苷、吲哚、糖( 醇及苷)類代謝等較系統(tǒng)的理化特性測定,具體方法參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[3]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[4]．

1.2.4 人工感染牛蛙試驗 將分離菌18 h培養(yǎng)物制成菌懸液，菌濃度稀釋為2.0×109/mL, 然后分別對100 g左右健康的牛蛙進(jìn)行腹腔注射感染,每尾注射劑量為0.5 mL．以注射等量無菌生理鹽水的健康牛蛙作為對照,根據(jù)菌種數(shù)量分為若干組， 另設(shè)多株菌混合感染組，其中每菌種菌液用量相等．各組注射試驗牛蛙各10尾．連續(xù)14 d觀察并記錄試驗牛蛙的病癥及死亡數(shù)目, 計算其死亡率．同時對人工感染發(fā)病瀕死的牛蛙進(jìn)行病原菌再分離, 檢查所分離的菌株與原分離菌株在形態(tài)與理化特性等方面是否一致．

1.2.5 藥物敏感試驗 按常規(guī)藥敏紙片法測定抗生素對分離菌株的抗菌譜, 以涂布法接種分離菌株, 然后將藥敏紙片貼在培養(yǎng)基上, 28 ℃培養(yǎng)18～24 h 后, 測定抑菌圈直徑,參照NCCLS判斷標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行敏感性判定．檢測的抗生素包括呋喃妥因、阿米卡星、氨芐西林/舒巴坦、氨曲南、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢他啶、氯霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、左氟沙星、美洛培南、美洛西林、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素、復(fù)方新諾明、頭孢曲松、頭孢吡肟、氨芐西林、強(qiáng)力霉素、磷霉素等21種，藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司．

2 結(jié)果

2.1 菌株分離結(jié)果

從患病大鯢的體表、肝臟、腎臟、腸道、四肢、腹水中共分離到12株細(xì)菌，分別編號為XCS10-1、XCS10-2、XCS10-3、XCS10-4、XCS10-5、XCS10-6、XCS10-7、XCS10-8、XCS10-9、XCS10-10、XCS10-11、XCS10-12．

2.2 分離菌的菌落形態(tài)及染色結(jié)果

經(jīng)過觀察和篩選，根據(jù)菌落特征，并通過革蘭氏染色初步鑒定分離的12株菌共分為3組細(xì)菌，從中再各選一株代表性菌株進(jìn)行系統(tǒng)鑒定，分別標(biāo)記為Y2010-1、Y2010-2、Y2010-3．

其中Y2010-1 的菌落直徑為2 mm 左右，乳白色、圓形、隆起、光滑．革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陽性，葡萄糖發(fā)酵試驗陽性；Y2010-2的菌落直徑為1.5 mm左右，白色半透明、圓形、隆起、光滑．革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陰性，葡萄糖發(fā)酵試驗陰性；Y2010-3 的菌落直徑為2 mm左右，白色透明、圓形、隆起、粗糙．革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陰性，葡萄糖發(fā)酵試驗陽性．3個株菌的形態(tài)見圖1．

圖1 Y2010-1、Y2010-2、Y2010-3株菌(從左至右)的形態(tài)(Gram染色，100× )

2.3 分離菌的生理生化特性及菌種鑒定結(jié)果

根據(jù)細(xì)菌的形態(tài)特征及生理生化鑒定結(jié)果，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[3]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[4]，確定分離的3組純病原菌Y2010-1、Y2010-2、Y2010-3 分別為布拉克枸櫞酸桿菌(Citrobacterbraakii)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)和洛菲不動桿菌(Acinetobacterlwoffi) (見表1)．

表1 分離菌株生理生化反應(yīng)

注：+代表陽性；-代表陰性

2.4 分離菌的人工感染試驗

將分離出的菌株Y2010-1、Y2010-2、Y2010-3分別和混合注射感染健康牛蛙, 感染后第三天各組均有牛蛙死亡，直至第六天Y2010-1和混合感染組仍有蛙死亡，但第七天至第十四天, 均未再出現(xiàn)死亡．其中混合組感染牛蛙死亡率高達(dá)100%，Y2010-2死亡率為80%，Y2010-1死亡率為50%,Y2010-3死亡率為40%，而對照組牛蛙均未發(fā)現(xiàn)病變及死亡(見表2).

表2 健康牛蛙人工感染結(jié)果

觀察病死蛙部分有大鯢自然發(fā)病相似病變，大鯢體表病變見圖2所示．3種菌分別感染致死的牛蛙均有體表出血或充血腫脹癥狀，但3種菌混合感染的病蛙還有皮膚局部潰爛，眼球外突等大鯢自然發(fā)病相似病狀(見圖3)，腹部積有多量腹水，肝臟呈現(xiàn)腫大等病癥．從人工感染瀕死的牛蛙體內(nèi)又分離到與原分離菌株形態(tài)特征及生理生化特性一致的細(xì)菌．

A B圖2 自然發(fā)病大鯢的體表病變

圖3 人工感染后牛蛙的體表病變

2.5 藥敏試驗結(jié)果

3個被測致病菌株對21種抗菌藥物的敏感性見表3．

表3 分離菌株的藥物敏感性試驗結(jié)果

注：R表示耐藥，S表示敏感，I表示中介.

表3表明，3種致病菌對供試抗菌藥均存在不同程度的耐藥性，僅對美洛培南敏感，對大鯢鉺料中添加的慶大霉素都不敏感．

3 討論

在人工養(yǎng)殖過程中，我國已經(jīng)確認(rèn)大鯢發(fā)生細(xì)菌性疾病的病原先后有熒光假單胞菌、遲鈍愛德華菌、惡臭假單胞菌、殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種、維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、弗氏檸檬酸桿菌、柱狀黃桿菌、溫和氣單胞菌等[6-15]．本研究從大鯢細(xì)菌性感染綜合癥病鯢體內(nèi)除分離到嗜水氣單胞菌外，還分離到布拉克枸櫞酸桿菌、洛菲不動桿菌，雖然孟彥等[11]也從大鯢腹水病體分離到洛菲氏不動桿菌、費(fèi)氏枸櫞酸桿菌以及蠟樣芽孢桿菌3種菌，但認(rèn)為只有嗜水氣單胞菌對大鯢有致病性，而否定了這3種菌是大鯢的病原菌.作者用牛蛙作致病性實驗的結(jié)果表明，從大鯢分離的嗜水氣單胞菌、布拉克枸櫞酸桿菌、洛菲不動桿菌對牛蛙的死亡率分別為80%、50%和40%，盡管發(fā)病動物呈現(xiàn)急性死亡表現(xiàn)，皮膚潰爛不明顯，死亡率都未達(dá)100%，嗜水單胞菌的致病性也比前人研究的有所降低，但各攻毒組均有牛蛙死亡，尤其是3種菌混合感染的致病性明顯增強(qiáng)，出現(xiàn)全部死亡，腫脹、潰爛等疾病癥狀更為典型.這一結(jié)果一方面說明牛蛙與大鯢均屬兩棲類，其生物學(xué)特性與對病原菌的敏感性存在差異但極為相近， 另外說明3種菌混合感染確實會增加相互的致病性，大鯢自然發(fā)病時表現(xiàn)多種癥狀和病變與多種細(xì)菌感染有關(guān)，這3種菌都是大鯢細(xì)菌性感染綜合癥的病原菌，本試驗為該病的多病原綜合感染的發(fā)生及機(jī)制提供了一定的理論與實驗依據(jù)．

在人和珍稀動物病原菌的致病力實驗中，往往采用小動物替代本動物作為實驗動物.大鯢是國家二類保護(hù)動物，目前價格昂貴，資源有限，實驗中很難用于大鯢病原的人工感染實驗，選用并建立其適宜的實驗動物模型有一定理論意義和應(yīng)用價值，王印、鐘蕾、王 旭和余波[10，12，14-15]等分別用斑點叉尾鮰、鯽魚、小鼠、鱉進(jìn)行過大鯢病原菌的人工感染試驗，雖然有不錯的結(jié)果，但無論從本試驗結(jié)果和動物差異性上分析，同為兩棲類，牛蛙代替用于大鯢其致病性試驗的低成本、可靠性、準(zhǔn)確性和可行性均是值得首推的，不過這仍有待進(jìn)一步驗證．

布拉克枸櫞酸桿菌(Citrobacterbraakii)又稱布拉克檸檬酸桿菌,常寄生于人和動物腸道，廣泛分布于自然界及醫(yī)院環(huán)境中，屬條件致病菌．據(jù)報道，本菌雖仍不是臨床十分常見菌株，但發(fā)生感染的頻率較過往有所增加，且感染的部位廣泛，以呼吸道為主，其次為傷口和膿腫[16-17]. 劉紅梅等[18]研究表明，枸櫞酸桿菌對常用的抗菌藥物呈現(xiàn)出不同程度的耐藥現(xiàn)象, 172株枸櫞酸桿菌對氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢西丁的耐藥率較高, 達(dá)87%以上, 對阿米卡星、亞胺培南、舒普深的耐藥率較低, 均小于20%．高正勇等[19]從大鯢細(xì)菌性感染病分離出的致病菌為弗氏枸櫞酸桿菌，藥敏試驗表明其對氨曲南、頭孢三嗪、先鋒噻肟、先鋒必等9 種藥物敏感;對氧哌嗪青霉素、左氟沙星、米諾環(huán)素、壯觀霉素、卡那霉素、對氟沙星、氟哌酸、頭孢西丁、環(huán)丙沙星、妥布霉素中度敏感; 對四環(huán)素、克林霉素、紅霉素、克拉霉素、氯霉素等16 種藥物不敏感．

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)是一類廣泛存在于水環(huán)境的常見菌, 它能引發(fā)多種水生動物的傳染病.有關(guān)嗜水氣單胞菌致病性的研究，已有過大量的報道[20]．郭闖等[21]從患病甲魚、河蟹、牛蛙、鯽體內(nèi)共分離到14 株氣單胞菌屬細(xì)菌，經(jīng)鑒定，其中8株為嗜水氣單胞菌．其對羧芐青霉素、青霉素G、氨芐青霉素、苯唑新霉素等藥物均為耐藥,而對喹諾酮類、鏈霉素、慶大霉素、氟苯尼考等藥物高度敏感．汪開毓等[2]從大鯢細(xì)菌性感染病中分離出的致病菌為嗜水氣單胞菌．藥敏試驗表明, 嗜水氣單胞菌對氟苯尼考、鏈霉素、環(huán)丙沙星、氟潔霉素和丁胺卡那霉素最敏感, 對新霉素次之, 而對四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、青霉素、頭孢菌素、磺胺異嚼唑、氟哌酸不敏感．

洛菲不動桿菌(Acinetobacterlwoffi)廣泛分布于水、土壤、人體皮膚、口腔黏膜呼吸道和泌尿道等部位，具有不動桿菌的耐藥特性,是一種條件致病菌, 隨著廣譜抗生素的大量應(yīng)用，其感染及耐藥性日趨嚴(yán)重，其臨床多重耐藥性也屢見報道[22]．但在水產(chǎn)養(yǎng)殖上，對該菌報道不多見．濮本恒等[23]對洛菲不動桿菌的耐藥性檢測結(jié)果顯示,該菌對妥布霉素、氧哌嗪青霉素/他唑巴坦、慶大霉素、頭孢西丁、加替沙星、左氧沙星、環(huán)丙沙星耐藥率在30%左右，氨曲南、氨芐青霉素/青霉烷砜、頭孢噻肟、復(fù)方新諾明、頭孢唑啉、氨芐青霉素的耐藥率均大于60%．

本研究中所進(jìn)行的藥敏試驗表明，3種病原菌對哌拉西林/他唑巴坦和美洛培南敏感，對慶大霉素都不敏感，且存在不同程度的耐藥性．這也解釋了養(yǎng)殖過程中添加慶大霉素效果不明顯的原因，且病原菌對大部分的廣譜抗生素都產(chǎn)生一定耐藥性，這和前人相關(guān)研究結(jié)果不盡相同,這可能是由于不同地方、不同養(yǎng)殖環(huán)境中養(yǎng)殖大鯢病原菌因接觸不同的藥物環(huán)境影響而產(chǎn)生的耐藥性變異．隨著抗生素類藥物的濫用以及許多新的診療方法的使用, 使得病原微生物的種類和耐藥性發(fā)生了改變, 許多條件致病菌已成為主要的致病菌, 原來對臨床常用抗菌藥物敏感的致病菌和條件致病菌, 逐步變成多重耐藥菌甚至是泛耐藥菌, 而細(xì)菌的耐藥性常常是不可逆的, 這無疑給治療大鯢細(xì)菌性疾病帶來了難度．如今, 細(xì)菌的耐藥性已成為全球性問題．合理使用抗生素類藥物, 對防治日益嚴(yán)重的感染、減少耐藥菌的產(chǎn)生以及控制耐藥菌的傳播均具有十分重要的意義．

參考文獻(xiàn)：

[1] 葉昌嬡,費(fèi) 梁,胡淑琴.中國珍稀及經(jīng)濟(jì)兩棲動物[M].成都:四川科學(xué)技出版社, 1993: 64-69.

[2] 汪開毓,黃錦爐,陳德芳,等.中國大鯢細(xì)菌性感染綜合癥的診治[J].科學(xué)養(yǎng)魚, 2009(3): 254-255.

[3] 東秀珠, 蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2001:364-398.

[4] 布坎南 R E, 吉本斯 N E. 伯杰細(xì)菌鑒定手冊[M]. 中國科學(xué)院微生物研究所,譯.9版. 北京: 科學(xué)出版社, 1994:729-759.

[5] National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[S]. Eighteenthinformational supplement. NCCLS document M100-S18, 2008：25-61.

[6] 王高學(xué)，白占濤．張向前．等．大鯢赤皮病病原分離鑒定及防治試驗[J]．西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 1999，27(4)：71-74．

[7] 蔣文華, 鄭邦友.地下防空洞內(nèi)大鯢飼養(yǎng)與爛尾病防治的研究[J].水利漁業(yè)， 2004，24(1)：30-31.

[8] 吳中明，王 歡，敖弟書，等.大鯢的遲鈍愛德華菌感染[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報， 2007，30(4)：464-466.

[9] 趙 虎，張 鵬，陳玖華，等.大鯢惡臭假單胞菌的分離及鑒定[J].河南水產(chǎn)， 2008，77(4)：40-41.

[10] 王 印，林躍華.大鯢腐皮病病原的分離鑒定與藥敏試驗[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)， 2009(7)：89-90.

[11] 孟 彥, 曾令兵, 楊焱清, 等. 大鯢腹水病病原菌的分離與鑒定研究[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版, 2009，37(3):77-81.

[12] 鐘 蕾，劉大志，肖調(diào)義，等.大鯢細(xì)菌性敗血癥病原分離及生物學(xué)特性研究[J].生物學(xué)雜志， 2010，27(4)：11-14.

[13] 鐘 蕾, 肖調(diào)義, 劉曉燕, 等. 大鯢細(xì)菌性敗血癥的組織病理學(xué)觀察[J].湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報， 2009，32(3)：84-88.

[14] 王 旭, 顏其貴, 雷 燕, 等. 中國大鯢腐皮病病原菌的分離與鑒定[J].中國人獸共患病學(xué)報， 2010，26(10)：944-948.

[15] 余 波, 徐景峨, 譚詩文 ,等. 大鯢細(xì)菌性敗血癥病原的分離鑒定與藥敏特性[J].中國獸醫(yī)雜志， 2011，47(1)：30-31.

[16] PATERSON D L, BONOMO R A. Extended-spectrumβ-lactamases: a clinical update[J]. Clin Microbiol Rev, 2005,18(4):657-686.

[17] TRAN J H, JACOBY G A, HOOPER D C. Interaction of the plasmidencoded quinolone resistance protein Qnr with Escherichia coli DNA gyrase[J].Antimicrob Agents Chemocher, 2005,49(1):118-125.

[18] 劉紅梅, 姜玉昌.枸櫞酸桿菌醫(yī)院感染特點及耐藥性檢測[J]. 中國實驗診斷學(xué), 2011,15(6):1083-1085.

[19] 高正勇，曾令兵，孟 彥,等. 患病大鯢中弗氏檸檬酸桿菌的分離與鑒定[J]. 微生物學(xué)報, 2012, 52(2):169-176.

[20] 戴振炎，劉小燕，陳冬香，等.斑點叉尾鮰敗血癥病原的分離與鑒定[J].湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報， 2011，34(1)：65-70.

[21] 郭 闖, 朱國強(qiáng), 王永坤,等. 14株患病水生動物氣單胞菌屬細(xì)菌的分離鑒定與最佳治療藥物篩選試驗[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2003,22(4):14-17.

[22] 龐雪云，田碧文，孫 蕾,等. 17例多重耐藥洛菲不動桿菌感染的實驗和中西醫(yī)結(jié)合治療分析[J]. 實用醫(yī)技雜志， 2006，13(9)：1431-1432.

[23] 濮本恒，華 群. 97株洛菲不動桿菌的分布及耐藥分析[J]. 中國廠礦醫(yī)學(xué)， 2009，22(6):714-715.