舒班超，麻武仁，尹 朋，劉鳳華，侯曉林，鐘友剛，余 進(jìn)，徐霄龍，萬長(zhǎng)榮，宋曉平，許劍琴

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌712100；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀100193；3.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，北京 昌平102206）

運(yùn)輸應(yīng)激廣泛發(fā)生在動(dòng)物的運(yùn)輸過程中，運(yùn)輸途中的各種刺激因子，對(duì)動(dòng)物造成的心理和生理上的影響統(tǒng)稱為運(yùn)輸應(yīng)激。運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)動(dòng)物是一種強(qiáng)烈的刺激，動(dòng)物經(jīng)過運(yùn)輸應(yīng)激后易產(chǎn)生生長(zhǎng)停滯、免疫抑制和組織損傷，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致動(dòng)物死亡。由于運(yùn)輸應(yīng)激是多種應(yīng)激原對(duì)機(jī)體的綜合作用，給運(yùn)輸應(yīng)激反應(yīng)機(jī)理研究帶來較大困難。動(dòng)物對(duì)于運(yùn)輸途中的搖晃、高溫／低溫、震動(dòng)、碰撞、噪音、饑渴、擁擠等刺激易產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)［1］。本試驗(yàn)利用搖床模擬了對(duì)運(yùn)輸應(yīng)激中較為重要的6個(gè)應(yīng)激因子：搖晃、高溫、碰撞、噪音、饑渴、擁擠，并將搖晃與溫度刺激分別固定在60r／min與35℃，以使其得到重復(fù)性較好的大鼠運(yùn)輸應(yīng)激模型。運(yùn)輸應(yīng)激會(huì)造成動(dòng)物重要器官如心臟、肝臟、腎臟等一定程度的損傷［2］，而關(guān)于小腸與運(yùn)輸應(yīng)激的關(guān)系尚未有人報(bào)道。小腸是機(jī)體消化吸收的重要器官，又被稱為應(yīng)激反應(yīng)的啟動(dòng)器官，在應(yīng)激反應(yīng)中小腸黏膜最先遭受損傷，并導(dǎo)致腸道黏膜免疫屏障遭受破壞，腸道致病微生物的入侵會(huì)進(jìn)一步加劇應(yīng)激反應(yīng)，并最終導(dǎo)致應(yīng)激綜合征。

Hsps稱為熱休克蛋白家族，主要分為：Hsp90家族、Hsp70家族、Hsp60家族及小分子量Hsp27家族［3］，Hsp27是Hsp27亞家族中的重要一員，主要參與微絲的穩(wěn)定和細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，保護(hù)細(xì)胞免受各種應(yīng)激因素的損傷［4］，Hsp70家族在幾乎所有生物的應(yīng)激細(xì)胞中都經(jīng)常高度地被誘導(dǎo)，廣泛參與各種保護(hù)機(jī)體和細(xì)胞的功能，在運(yùn)輸應(yīng)激部分器官中也會(huì)高度表達(dá)。Hsp90作為特異分子伴侶調(diào)節(jié)蛋白的生物活性，防止蛋白質(zhì)的變性和聚集。它們對(duì)維護(hù)細(xì)胞生存和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定有重要意義。然而動(dòng)物運(yùn)輸應(yīng)激后Hsps在空腸中的表達(dá)情況，以及其與空腸損傷的關(guān)系尚罕見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性SD大鼠20只（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供），體重為270±20g。

1.2 主要儀器和試劑 儀器 DHZ－CA型水平搖床（江蘇太倉(cāng)儀器廠，中國(guó)）；Leica RM 2126RT型切片機(jī)（上海錸卡儀器有限公司，上海）；Olympus BX51生物顯微鏡（Olympus，日本）；BIO－RAD My－Cycler PCR 儀（BIO－RAD， 美 國(guó)）；Stratagene Mx3005P熒光定量PCR系統(tǒng)（Stratagene，美國(guó)）。試劑：蘇木精，依紅，Trizol Reagent（Invitrogen，USA）；M－MLV 反轉(zhuǎn)錄酶（Promeage USA）；RNA酶抑制劑（Promega，USA）；Brilliant II Fast SYBR Green QPCR Master Mix（Agilent Technologies，USA）。

1.3 運(yùn)輸應(yīng)激大鼠模型的建立 將20只270±20 g的SD大鼠適應(yīng)性飼喂1周后，隨機(jī)均分為4組：對(duì)照組、運(yùn)輸應(yīng)激1d組、運(yùn)輸應(yīng)激2d組、運(yùn)輸應(yīng)激3d組。應(yīng)激條件為35℃，60r／min，每天應(yīng)激2h。應(yīng)激后大鼠出現(xiàn)運(yùn)輸應(yīng)激臨床癥狀，以及血清皮質(zhì)醇濃度升高，表明模型構(gòu)建成功。

1.4 取材及材料處理 應(yīng)激結(jié)束后，各組大鼠分別先進(jìn)行體重與肛溫測(cè)定；眼球靜脈采血，分離血清進(jìn)行皮質(zhì)醇的測(cè)定；最后斷頭處死，暴露腹腔，分離腸道。將空腸組織分別放入4%中性甲醛溶液中固定或在液氮中冷凍保存。固定好的組織用于常規(guī)石蠟切片的制備，凍存的樣品則用于RNA提取與熒光定量PCR。

1.5 體重與肛溫測(cè)定 應(yīng)激前后分別利用電子天平對(duì)大鼠進(jìn)行體重測(cè)量，用電子溫度計(jì)插入肛門5cm處進(jìn)行肛溫測(cè)量。

1.6 血液生化指標(biāo) 血清中皮質(zhì)醇（Cortisol）測(cè)定則采用放射免疫方法。

1.7 空腸病理組織學(xué)觀察 剖腹，取距Treitz韌帶下10cm的近端空腸3cm，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。病理學(xué)檢查標(biāo)本用4%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，組織塊包埋時(shí)力求方向垂直。標(biāo)本經(jīng)常規(guī)石蠟包埋后，做腸管橫切面的連續(xù)切片，切片厚度為5μm。切片后H.E.染色，鏡檢。

1.8 RNA提取與cDNA合成 取凍存空腸標(biāo)本50mg，使用Trizol法提取總RNA。核酸蛋白儀檢測(cè)RNA濃度與純度，只有260／280比值介于1.9～2.1的RNA用于反轉(zhuǎn)錄。使用2μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄采用兩步法完成，cDNA產(chǎn)物－20℃保存。

1.9 熒光定量RT－PCR測(cè)定大鼠空腸中 Hsps mRNA的轉(zhuǎn)錄 根據(jù)GenBank上大鼠Hsp27、Hsp70和Hsp90的基因序列，利用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件分別設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，引物序列見表1。采用SYBR GREEN法對(duì)運(yùn)輸應(yīng)激前后大鼠空腸組織Hsps表達(dá)量進(jìn)行熒光定量PCR分析。PCR反應(yīng)體系如下：cDNA模板1μL、PCR Mix 10 μL、ROX 0.3μL，上下游引物各1μL，用滅菌蒸餾水加至20μL。擴(kuò)增條件為95℃10min；95℃10 s，60℃30s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)，收集熒光值；循環(huán)結(jié)束檢測(cè)融解曲線。大鼠Hsps mRNA的定量結(jié)果均用β－actin mRNA 的含量作歸一化 處理。

表1 Hsps引物序列

1.10 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”（X±SEM）表示，采用SPASS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行One－Way ANOVA比較，P＜0.05記為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)大鼠行為的影響 大鼠在運(yùn)輸應(yīng)激過程初期先表現(xiàn)為好動(dòng)，適應(yīng)后逐漸安靜。隨著應(yīng)激時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠開始表現(xiàn)出焦慮，逃逸行為，并且開始吐沫，最后階段表現(xiàn)為精神委靡。若應(yīng)激時(shí)間長(zhǎng)于3h則大鼠發(fā)生死亡。

2.2 運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)大鼠體溫與體重的影響 運(yùn)輸應(yīng)激1d和3d后，大鼠肛溫對(duì)比應(yīng)激前顯著上升（圖1A）。表明運(yùn)輸過程中大鼠代謝速率加快，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)熱增加。運(yùn)輸應(yīng)激1d和3d后，大鼠體重顯著降低（圖1B）。說明，在運(yùn)輸應(yīng)激過程中，大鼠消耗了大量的體能，致使機(jī)體體重降低。2.3 運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)大鼠血液皮質(zhì)醇的影響 大鼠分別應(yīng)激1d和3d后，相對(duì)于對(duì)照組血清中皮質(zhì)醇濃度均顯著升高，應(yīng)激2d后皮質(zhì)醇濃度相對(duì)于對(duì)照組升高但不顯著（圖2），說明大鼠已處于應(yīng)激狀態(tài)。大鼠運(yùn)輸過程中的行為變化，體溫升高、體重降低，以及皮質(zhì)醇濃度的升高，表明運(yùn)輸應(yīng)激模型構(gòu)建成功。

2.4 運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)大鼠空腸形態(tài)H.E.染色觀察H.E.染色后光鏡下觀察可見，對(duì)照組大鼠空腸腸結(jié)構(gòu)完整，層次分明，腸黏膜上皮細(xì)胞的輪廓清晰，排列規(guī)則。柱狀上皮細(xì)胞，呈高柱狀單層排列，胞漿豐富，胞核橢圓形，位于細(xì)胞基部。杯狀細(xì)胞散在于柱狀上皮細(xì)胞之間，呈高腳杯狀（圖3A）。而運(yùn)輸應(yīng)激后1，2，3d，大鼠空腸黏膜均受不同程度損傷，絨毛頂部上皮細(xì)胞部分脫落現(xiàn)象（圖3），從小腸的前段到后段，損傷程度逐漸減輕。第1天運(yùn)輸應(yīng)激大鼠空腸結(jié)構(gòu)變化，主要表現(xiàn)為絨毛頂端上皮細(xì)胞部分脫落（圖3B），應(yīng)激第2天則表現(xiàn)為絨毛頂端上皮細(xì)胞成片剝離（圖3C），而應(yīng)激第3天絨毛大面積剝離，且絨毛長(zhǎng)度變短（圖3D）。杯狀細(xì)胞的數(shù)量也隨著應(yīng)激時(shí)間的增加而增加。

圖3 分別運(yùn)輸應(yīng)激1，2，3d后大鼠空腸H.E.染色圖片（200×）

2.5 空腸Hsps mRNA表達(dá)量變化 我們選取了具有代表性的運(yùn)輸應(yīng)激1d和3d的大鼠，分別代表單次應(yīng)激和多次應(yīng)激進(jìn)行基因表達(dá)水平研究。對(duì)于應(yīng)激2d的大鼠沒有繼續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)。由圖4可見，分別經(jīng)2h運(yùn)輸應(yīng)激1d和3d后，Hsp27、Hsp70、Hsp90mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比均顯著升高。其中Hsp27在應(yīng)激第1天升高8.6倍，在第3天則升高了10.5倍（圖4A）。Hsp70升高最為顯著，在第1天應(yīng)激結(jié)束后表達(dá)量上升了45.5倍，而第3天應(yīng)激結(jié)束時(shí)繼續(xù)升高至54倍（圖4B）。Hsp90第1天升高了3.6倍，應(yīng)激3d升高了3.3倍（圖4C）。

3 討論

運(yùn)輸應(yīng)激是動(dòng)物對(duì)運(yùn)輸途中多種應(yīng)激原刺激所做出的反應(yīng)。實(shí)際運(yùn)輸過程中由于應(yīng)激原條件變化較大，給科學(xué)評(píng)價(jià)機(jī)體對(duì)運(yùn)輸應(yīng)激反應(yīng)帶來較大困難。因此選取合適的儀器進(jìn)行模擬，并對(duì)應(yīng)激條件進(jìn)行固定，有一致［1，5］，表明利用搖床在60r／min，35℃，2h的條件下可以很好的模擬公路運(yùn)輸應(yīng)激。

先前研究表明，運(yùn)輸應(yīng)激可以引起心臟、肝臟、腎臟發(fā)生損傷，本試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)運(yùn)輸應(yīng)激也會(huì)引起空腸的明顯損傷。伴隨著應(yīng)激時(shí)間的增加，大鼠空腸結(jié)構(gòu)發(fā)生病理變化，損傷逐漸加重?？漳c絨毛從頂端上皮細(xì)胞部分脫落，變?yōu)榻q毛上皮細(xì)胞成片剝離，最后呈現(xiàn)為絨毛上皮細(xì)胞大面積剝離，且絨毛長(zhǎng)度變短。應(yīng)激時(shí)機(jī)體內(nèi)熱休克蛋白的表達(dá)量會(huì)發(fā)生急劇變化，以保護(hù)組織細(xì)胞免受傷害。細(xì)胞內(nèi)Hsp尤其是Hsp27和Hsp70可抑制應(yīng)激激活蛋白激酶，抵制細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的蛋白水解酶和氧自由基生成，并抑制p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而可在熱應(yīng)激、氧化應(yīng)激、電離射線等引起的細(xì)胞凋亡中起保護(hù)作用［6］。據(jù)李玉保等人報(bào)道，豬經(jīng)1、2、4、6h和10h的運(yùn)輸應(yīng)激后，在豬腎臟［7］、肝臟和心臟［8］組織中Hsp70mRNA的轉(zhuǎn)錄水平隨著應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)一直呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)［9］。同樣在Hsp90的研究上，李玉保、鮑恩東等人報(bào)道，Hsp90mRNA表達(dá)量在肝臟和心臟［8］中上升。在我們的試驗(yàn)中，我們得到了相似的結(jié)果，大鼠空腸中 Hsp27，Hsp70，Hsp90mRNA的表達(dá)量在運(yùn)輸應(yīng)激后均顯著上升。相比應(yīng)激第1天，應(yīng)激第3天Hsp27與Hsp70mRNA表達(dá)量持續(xù)升高，而Hsp90mRNA的表達(dá)量則在第3天較第1天有所下降。

本試驗(yàn)中隨著大鼠運(yùn)輸應(yīng)激時(shí)間增加，空腸病理變化逐漸加重，同時(shí)Hsp27，Hsp70，Hsp90的表達(dá)量也大幅升高。表明大鼠空腸組織損傷與Hsps表達(dá)量之間有著直接的聯(lián)系。運(yùn)輸應(yīng)激中Hsp27，Hsp70可能參與了對(duì)抗運(yùn)輸應(yīng)激所引起的損傷與凋亡。Hsp90則可能主要在運(yùn)輸應(yīng)激中參與修復(fù)應(yīng)激中損傷的蛋白分子。作為一類保護(hù)性分子，Hsps在大鼠運(yùn)輸應(yīng)激后空腸組織內(nèi)表達(dá)量急劇升高，可以起到保護(hù)空腸組織細(xì)胞，抵抗應(yīng)激性損傷的作用。運(yùn)輸應(yīng)激后表達(dá)量急劇升高的Hsps，可能是動(dòng)物抵抗運(yùn)輸應(yīng)激的重要機(jī)制之一。

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