李公美，胡靜濤，李玉梅，李茂輝，閆金明，劉可越，錢愛東

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，長(zhǎng)春 130118;2.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)春 130062;3.吉林正大實(shí)業(yè)有限公司，長(zhǎng)春 130033;4.九江學(xué)院，江西九江 332000)

干擾素(interferon，IFN)是在特定的誘導(dǎo)劑作用下由細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有高度生物學(xué)活性的糖蛋白，能使機(jī)體迅速獲得抗病毒和抗腫瘤等多方面功能[1]。IFN根據(jù)其細(xì)胞來源、生化特性及生物學(xué)活性差異，將干擾素分為兩大類:I類(IFN-α、IFN-β、IFN- ω 和 IFN- ζ)和 II類(IFN- γ)[2]，I型干擾素主要由病毒和微生物誘導(dǎo)產(chǎn)生，Ⅱ型干擾素主要由淋巴細(xì)胞受有絲分裂原或特異性抗原刺激產(chǎn)生。IFN-α可抑制感染細(xì)胞中病毒mRNA翻譯，并促使病毒mRNA降解，提高細(xì)胞表面MHC I類分子的表達(dá)水平，有助于向T細(xì)胞遞呈抗原，引起靶細(xì)胞的溶解，并可增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)病毒的殺傷能力[3]。

養(yǎng)鵝業(yè)是我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)中重要的支柱產(chǎn)業(yè)，許多病毒性疾病(如鵝細(xì)小病毒、鵝副粘病毒等)仍嚴(yán)重危害養(yǎng)鵝業(yè)。目前該類疾病的防治相對(duì)較落后，由于干擾素具有調(diào)節(jié)機(jī)體的體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)細(xì)菌、寄生蟲和病毒感染的抵抗力，所以對(duì)其進(jìn)行研究一直是細(xì)胞因子研究方面的重點(diǎn)之一。1994年，Sekellick等首次成功克隆和表達(dá)ch IFN-α基因并進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。1995年Schultz等[4]報(bào)道了鴨干擾素，并開展了鴨基因工程干擾素抗病毒的研究，Quere等[5-6]利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的重組gIFN-ɑ在禽病毒性疾病的臨床治療中得到了初步應(yīng)用，而大腸桿菌作為基因工程表達(dá)系統(tǒng)，具有操作簡(jiǎn)單、生產(chǎn)周期短、成本低、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，因此本研究旨在利用大腸桿菌建立高效gIFN-ɑ體外表達(dá)體系，同時(shí)制備兔抗鵝IFN-ɑ多克隆抗血清，為gIFN-ɑ的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒與毒株 鴨瘟病毒由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，含吉林白鵝IFN-α(JL-G-IFN-α)基因重組質(zhì)粒pMD-T-IFN-α由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，E．coli BL21(DE3)、pGEX-6p-1由吉林大學(xué)獸醫(yī)研究所饋贈(zèng)。

1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶BamH I、EcoR I、Taq DNA聚合酶及T4 DNA連接酶等均來自寶生物工程(大連)有限公司;IPTG、DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)粒DNA抽提試劑盒、DNA凝膠回收純化試劑盒為杭州維特潔生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;酵母浸出粉、胰蛋白胨為Oxoid公司產(chǎn)品;DMEM培養(yǎng)基、小牛血清，Invitrogen公司。GST融合蛋白純化試劑盒為Amersham Pharmacia公司產(chǎn)品，低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)、預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)為北京天根有限公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計(jì)與目的基因PCR擴(kuò)增 根據(jù)Gen-Bank上已發(fā)表的灰雁 IFN-ɑ序列(登錄號(hào):HQ009755)，用Primer 5.0軟件在其完整的閱讀框架外設(shè)計(jì)上、下游引物，引物序列分別為P1:5'AT->AGGATCCAACATGCCTGGGCCATCAG 3';P2:5'TCCGAATTCTTAGCGCATGGTGCGG 3'，劃線部分分別為BamH I和EcoR I酶切位點(diǎn)，引物由大連寶生物工程有限公司合成。

1.4 鵝IFN-α基因的PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物回收

以重組質(zhì)粒pMD-T-IFN-ɑ為模板，PCR擴(kuò)增IFN-ɑ，PCR 反應(yīng)體系:ddH2O 37.5 μL、10×PCR Buffer 5 μL、mix dNTPs(10 mmol/L)1 μL、IFN- ɑ P1(20 pmol/L)/IFN-ɑ P2(20 pmol/L)各1 μL、重組質(zhì)粒 JL-GoIFN-α(0.5 mg/mL)1 μL、ExTaq酶(5 u/μL)0.5 μL，補(bǔ)超純 50 μL，混勻。PCR 反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性8 min，94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min，0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定反應(yīng)產(chǎn)物，用凝膠回收純化試劑盒回收目的片段。

1.5 重組表達(dá)載體pMD-IFN-ɑ的構(gòu)建 用BamH I和EcoR I雙酶切含鵝IFN-α基因T載體，插入到同樣經(jīng) BamH I和 EcoR I雙酶切的pGEX-6p-1表達(dá)載體的大片段中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-IFN-ɑ。轉(zhuǎn)化、篩選陽性克隆，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和BamH I、EcoR I酶切鑒定，對(duì)初步篩選出的陽性克隆送至寶生物工程(大連)有限公司測(cè)序。

1.6 重組質(zhì)粒pGEX-IFN-ɑ的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

將鑒定正確的重組質(zhì)粒pGEX-IFN-ɑ轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌BL21中，挑單個(gè)菌落接種于5 mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)。待菌液OD值為0.6～1.0時(shí)，加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h后收集菌體，同時(shí)設(shè)只含表達(dá)載體pGEX-6p-1的BL21和誘導(dǎo)后pGEX-6p-1的BL21對(duì)照。將誘導(dǎo)表達(dá)菌裂解產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE和Western-blot。

1.7 重組鵝IFN-α純化 根據(jù)谷胱甘肽瓊脂糖-4B(Glutathione Sepharose-4B)操作說明書純化GST融合蛋白:(1)將谷胱甘肽瓊脂糖-4B基質(zhì)轉(zhuǎn)移至一次性的小柱子;(2)輕扣小柱以除氣泡，然后讓谷胱甘肽瓊脂糖-4B基質(zhì)著床;(3)移去底蓋;(4)加入10倍體積的1×PBS洗滌2次;(5)在基質(zhì)中每次加入100 μL GST reduction elution buffer洗脫GST融合蛋白;(6)收集洗脫液。用SDSPAGE電泳檢查純化蛋白的純度，蛋白的濃度用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒確定。

1.8 多克隆抗血清的制備 將1 mL純化蛋白(含目的蛋白0.25 mg/mL)加入1 mL弗氏完全佐劑中制成油乳劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射免疫2月齡新西蘭白兔(由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供);首免后14 d和28 d分別用純化蛋白1 mL(含目的蛋白0.25 mg/mL)加入弗氏不完全佐劑進(jìn)行第二次和第三次加強(qiáng)免疫，第三次免疫后10 d于心臟中采血處死兔子，按常規(guī)方法采血分離血清。將制備的血清按 1 ∶100、1 ∶200、1 ∶400、1 ∶800、1 ∶1600、1 ∶3200、1 ∶6400、1 ∶12800、1 ∶25600、1 ∶51200 稀釋，以正常兔血清為陰性對(duì)照，與1∶100稀釋的純化的鵝IFN-ɑ按常規(guī)方法進(jìn)行ELISA檢測(cè)[7]。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pGEX-IFN-ɑ的鑒定 對(duì)重組質(zhì)粒pGEX-IFN-ɑ進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果在約570 bp處得到了1條目的條帶;用BamHⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，分別在約4900 bp和約570 bp處出現(xiàn)1條帶(圖1)，與預(yù)期結(jié)果相符。將經(jīng)PCR和酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與鵝IFN-ɑ全基因的編碼序列完全一致。

圖1 重組質(zhì)粒pGEX-IFN-α的鑒定

2.2 重組鵝IFN-ɑ基因的表達(dá)及鑒定 SDSPAGE電泳結(jié)果顯示，含有重組質(zhì)粒pGEX-IFN-ɑ的重組菌液出現(xiàn)1條約為43.0 ku處的融合蛋白(GST-IFN-ɑ)，與預(yù)期結(jié)果相一致;而只含表達(dá)載體pGEX-6P-1的BL21，在26.0 ku處有1條明顯的蛋白帶(GST);未含重組質(zhì)粒和表達(dá)載體的宿主菌BL21，沒有出現(xiàn)這一條帶(圖2)。表明重組質(zhì)粒pGEX-IFN-ɑ在BL21中可誘導(dǎo)表達(dá)重組鵝ɑ干擾素融合蛋白。薄層掃描分析結(jié)果顯示，表達(dá)蛋白占菌體總蛋白的25%。SDS-PAGE電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素(NC)上，用GST單抗作一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)羊抗鼠IgG作二抗進(jìn)行Western blot檢測(cè)。結(jié)果(圖3)顯示，融合蛋白43.0 ku處出現(xiàn)一條特異條帶，同時(shí)表達(dá)空載體在26.0 ku處出現(xiàn)一條帶，因此根據(jù)分子質(zhì)量的大小推測(cè)，這條帶的相對(duì)分子質(zhì)量與目的蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量相同，表明誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白是重組的鵝ɑ干擾素。將目的蛋白直接置于去離子水中透析復(fù)性，復(fù)性率約為62%。

2.3 重組鵝IFN-ɑ的抗血清測(cè)定 用純化的重組gIFN-ɑ作為包被抗原，對(duì)制備的兔高免血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，結(jié)果表明，gIFN-α多克隆抗血清的抗體效價(jià)達(dá)1∶50000。

3 分析討論

干擾素具有廣譜抗病毒、抑制細(xì)胞增殖以及提高免疫功能等作用。由于病毒病一直困擾著我國(guó)的養(yǎng)鵝業(yè)，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此養(yǎng)鵝業(yè)生產(chǎn)中需要干擾素類廣譜抗病毒生物制劑來治療和加強(qiáng)疫苗的免疫效果。干擾素存在種屬特異性，雖然克隆到的DuIFN-Ⅰ基因與雞、哺乳動(dòng)物和人干擾素基因的同源性較低，但半胱氨酸殘基卻具有保守性?？寺〉降腄uIFN2Ⅰ基因存在著2個(gè)糖基化位點(diǎn)，這表明它與人和雞的Ⅰ型干擾素基因一樣，也是一種糖蛋白。夏春等[8]從鴨肝組織中提取基因組克隆到DuIFN-ɑ基因，Schultz等[4]報(bào)道了鴨干擾素，并開展了鴨基因工程干擾素抗病毒的研究，在1995年從HindⅢ消化的鴨基因組DNA中，用ChIFN-ɑ基因探針克隆了包含DuIFN-α基因的HindⅢ片段(2.7 kb)，分別在大腸埃希氏菌和COS細(xì)胞中完成了表達(dá)，并在鴨肝細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)中證實(shí)了其抗DHBV的能力。對(duì)人IFN的研究表明[10-11]，IFN除具有抗病毒活性外，還具免疫調(diào)節(jié)作用。Hurchen GUO 等[12]利用 pcDNA3.1/IFN-ɑ增強(qiáng)了FMD DNA疫苗的效果，該研究表明IFN-α作為佐劑的使用具有良好的應(yīng)用前景，因此對(duì)鵝IFN-ɑ成熟片段表達(dá)產(chǎn)物高效純化，獲得高效價(jià)多克隆抗體，為研究機(jī)體的免疫狀態(tài)及免疫機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)選用的是pGEX-6p-1，它是一種高效誘導(dǎo)的原核表達(dá)載體，所表達(dá)的目的蛋白可避免宿主菌蛋白酶的水解作用，純化方便，用特異性的蛋白酶可以從所表達(dá)的融合蛋白中切下目的蛋白質(zhì)或多肽;并且選用了適合于GST融合表達(dá)系統(tǒng)的宿主菌BL21(DE3)PlysS，該菌種缺少在細(xì)胞膜外的蛋白酶ompT的基因，還缺少多種蛋白酶，降低了重組產(chǎn)物表達(dá)后被細(xì)胞降解或剪切的概率。

本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)低溫誘導(dǎo)進(jìn)行優(yōu)化條件表達(dá)的蛋白始終以包涵體形式存在，盡管包涵體具有富集目標(biāo)蛋白質(zhì)、抗蛋白酶、對(duì)宿主菌毒性小等優(yōu)點(diǎn)，但包涵體蛋白質(zhì)的復(fù)性率一般都很低，這大大增加了基因工程產(chǎn)品的制造成本，本研究采用了谷胱甘肽-瓊脂糖柱進(jìn)行親和層析純化，得到了較純的融合蛋白，在得到純化的目的重組蛋白后，直接在純水中透析，去除變性劑，方法簡(jiǎn)單，且得到較高的復(fù)性率。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒pGEX-6p-1/gIFN-α轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)在43 ku處表達(dá)出了一條特異的融合蛋白帶，分子量與所推測(cè)的gIFN-α大小相符，蛋白產(chǎn)量約占菌體總蛋白的25%。在獲得復(fù)性后的gIFN-α后，對(duì)新西蘭兔進(jìn)行了三次免疫，制備的多克隆抗血清抗體效價(jià)達(dá)到1∶50000。本實(shí)驗(yàn)成功克隆表達(dá)、純化了gIFN-α重組蛋白，并獲得了兔抗gIFN-α多克隆抗血清，為重組鵝干擾素的臨床應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。

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