王曙光，楊文武，普曉蘭

(西南林業(yè)大學，云南昆明 650224)

思茅松［Pinus kesiya var.langbianensis(A.Chev.)Gaussen］主要分布于云南省普洱市及相鄰地區(qū)，是云南省重要的材脂兩用樹種。思茅松個體之間松脂產(chǎn)量存在很大的變異，產(chǎn)脂力最高可相差39倍以上(樓浙輝和舒洪嵐，2002)。這種產(chǎn)脂力的差異在我國的其它采脂樹種馬尾松、油松中也是普遍現(xiàn)象，但天然林分中，高產(chǎn)脂樹木的比例不到20%(李明，2003)。要提高松樹的產(chǎn)脂量，建立高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)采脂基地是松脂產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然選擇。因此，對高產(chǎn)脂力思茅松進行早期選擇，為思茅松高產(chǎn)脂林和用材林的定向培育提供基礎(chǔ)種源，對提高平均松脂產(chǎn)量及林分生產(chǎn)力，具有十分重要的生產(chǎn)實際意義。

分子標記輔助選擇育種(Marker Assist Selection簡稱MAS)，是利用分子標記構(gòu)建的遺傳圖譜使選擇直接基于DNA水平上，通過在分子水平上分析與目標基因緊密連鎖的分子標記的基因型來判別目標基因是否存在來進行早期選擇和對隱性基因的選擇，可為林木生長、抗性、材性等主要性狀的早期測定提供依據(jù)，由于不受其它基因效應(yīng)和環(huán)境因素的影響，大大提高了早期測定的精確度和可靠性。這將有助于克服林木世代長所帶來的局限性，提高選擇效果，縮短育種周期，加速育種進程，對生長周期長的林木具有重要意義(劉勛成等，2005)。

簡單重復序列間區(qū)標記技術(shù)(inter-simple sequence repest，ISSR)是由加拿大蒙特利爾大學的Zietkiewicz等(1994)首次提出的，是一種在PCR中直接使用微衛(wèi)星序列進行DNA擴增的分子標記技術(shù)，具有快速、高效的特點。并且具有很好的多態(tài)性和穩(wěn)定性，可同時提供多位點信息和揭示不同微衛(wèi)星座位個體間變異的信息。本文以產(chǎn)自云南省的思茅松為研究對象，通過提取思茅松胚乳基因組DNA，建立并優(yōu)化ISSR-PCR擴增的條件，為思茅松的分子輔助育種提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究的材料采自云南普洱市景谷縣，于40℃烘箱中烘干球果，取出種子，冰箱保存?zhèn)溆?。使用時，將種子浸于75% 的酒精溶液燒杯中，置于常溫48 h，取出后用蒸餾水洗滌，用滅過菌鑷子剝離種皮并小心去掉胚，只留下胚乳，放入-20℃冰箱中備用。

1.2 思茅松胚乳DNA的提取

采用改良SDS法和改良CTAB法提取思茅松胚乳DNA，對所得DNA進行濃度、純度及ISSR-PCR檢測，篩選出適合思茅松胚乳DNA提取的方法并用于思茅松胚乳DNA的提取。

1.3 DNA純度、濃度和產(chǎn)率的檢測

1.3.1 紫外分光光度計檢測

本試驗以TE為空白，在不同提取方法所得DNA隨機選取5個樣本，每個樣品取4 μL DNA用TE稀釋成400 μL，將待測的 DNA應(yīng)用 ULTROSPEC2000紫外分光光度計測定，分別測出OD260、OD280和OD260/OD280的值，每個樣本測5次后求得平均值，通過對比三者的大小，比較、分析兩種方法的優(yōu)劣。

1.3.2 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測

0.8 %瓊脂糖凝膠(含終濃度為0.5 μg·mL-1的溴化乙錠)，取6 μLDNA樣品與4 μL溴酚藍混合，用8 μL點樣后電泳，1×TAE緩沖液，電泳電壓8 V·cm-1，電泳時間2 h。凝膠自動成像系統(tǒng)掃描，照相，對照分析比較。

1.3.3 DNA的PCR擴增檢測

以7號樣為模板從購自上海生物工程公司的31個引物中進行引物初步篩選及復篩，從而建立相應(yīng)的反應(yīng)程序。PCR擴增反應(yīng)參照前人的工作(呂艷芳等，2003，劉彤等，2006)，擴增結(jié)果用1.6%瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)所得譜帶的條帶數(shù)目和清晰程度，確定兩種方法所提取的DNA質(zhì)量的優(yōu)劣。

1.4 ISSR-PCR擴增條件及反應(yīng)體系穩(wěn)定性檢測

雖然ISSR技術(shù)具有重復性高、操作簡單和檢測多態(tài)性十分敏感等優(yōu)點，但不同植物、不同試驗條件的PCR擴增的最適條件仍需優(yōu)化，以確定各主要影響因子的最適用量及最佳組合。

用單因子分析法分別對思茅松ISSR-PCR反應(yīng)體系中的模板DNA用量，Taq DNA聚合酶用量(大連寶生生物有限公司)，Mg2+濃度，dNTP濃度、引物濃度(上海生物工程公司合成)以及退火溫度等進行優(yōu)化，確定適用于本試驗的思茅松的反應(yīng)體系。

運用已經(jīng)優(yōu)化好的PCR反應(yīng)體系和程序，從購自上海生物工程公司的30個引物中篩選出10個出條帶清晰、穩(wěn)定性高、多態(tài)性好的引物，對思茅松不同產(chǎn)脂量的10個樣本進行PCR擴增，以確定DNA提取方法及所建立的ISSR-PCR擴增體系的可行性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取DNA結(jié)果比較分析

2.1.1 紫外分光光度計檢測結(jié)果

試驗中由SDS法和CTAB法所獲得DNA中各隨機選取5個樣本進行紫外分光光度檢測(表1)。

結(jié)果顯示所有樣品的 OD260/OD280值均高于1.6，說明無蛋白質(zhì)污染，即兩種方法在除去蛋白質(zhì)上效果相似。在DNA濃度上，SDS法總體濃度較CTAB法高，CTAB法僅個別樣品獲得高濃度的DNA，個體產(chǎn)率差異大，具有不穩(wěn)定性。主要是由于CTAB法提取步驟較多，損失的DNA量相應(yīng)增加，導致總體產(chǎn)率偏低，也可能和種子的個體差異存在一定的相關(guān)性。此外，CTAB法耗時較長。

表1 SDS法和CTAB法提取的基因組DNA紫外分析結(jié)果

3.1.2 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

從兩種方法所得DNA中各隨機選取5個樣本進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示。

圖1 SDS法和CTAB法提取DNA效果圖比較

其中1號～5號為SDS法所得DNA，6號 ～10號為CTAB法提取

從圖1可看出，種子胚乳DNA經(jīng)SDS法和CTAB法提取均能得到較清晰遷移條帶，但存在不同程度的降解。在去除雜質(zhì)方面，SDS法點樣孔中存在輕微的EB吸收，說明有多糖污染;而CTAB法提取DNA條帶電泳速度慢于SDS法，則可能由于多糖的粘連性所導致，同樣存在多糖污染。從帶的亮度和寬度上看，兩種方法在產(chǎn)率上都存在較大差異，就總體產(chǎn)量而言SDS法高于CTAB法，與紫外分光光度計檢測結(jié)果相符。

3.1.3 DNA的PCR擴增分析

以7號樣為模板進行引物初篩，結(jié)果見圖2。

從圖2中可看出，僅有少量引物能得到條帶，且都模糊不清背景條帶較重，說明該反應(yīng)體系不適合用于思茅松ISSR-PCR擴增，需對反應(yīng)體系及條件進行優(yōu)化以期得到較好的擴增結(jié)果。圖中7號點樣孔所用引物獲得條帶最多且最為清晰，選用該引物(即(GA)8)作為后續(xù)條件優(yōu)化的引物。

圖2 ISSR-PCR引物初篩效果圖

根據(jù)引物初步篩選的結(jié)果，篩選出到有擴增產(chǎn)物的引物，再用4個樣品對初篩有擴增產(chǎn)物的引物進行多態(tài)性復篩，所得結(jié)果如圖3所示:

圖3 ISSR-PCR引物復篩效果圖

從圖3中可看出，各引物所得條帶數(shù)、清晰度及多態(tài)性各不相同，我們從中挑選出4個條帶清晰、多態(tài)性好的引物對不同樣品進行擴增，以確定所建體系的實用性。所選4個引物基本信息如下:

表2 ISSR引物及其退火溫度

對通過SDS法和CTAB法兩種方法所得DNA以初選(GA)8引物進行ISSR-PCR擴增，結(jié)果如圖4所示:

從圖4中可看出，兩種方法均可得到清晰的DNA條帶，但CTAB法在進行PCR擴增時出現(xiàn)較多的缺帶，因此SDS法效果更佳。

圖4 不同提取方法所得DNA ISSR-PCR效果圖

3.2 思茅松ISSR-PCR擴增條件的優(yōu)化結(jié)果

3.2.1 DNA模板對反應(yīng)體系的影響

適宜的模板量是保證特異性擴增的前提，模板量過多會增加非特異性的擴增形成背景，從而降低特異性擴增效率。本試驗在20 μL反應(yīng)體系中加入DNA 的量分別為:20 ng、30 ng、40 ng和50 ng。

圖5 DNA模板濃度梯度比較

從圖5中可看出，當DNA量為50 ng時，擴增條帶多，但同時出現(xiàn)彌散現(xiàn)象，帶型模糊，條帶彼此間難以分清，說明模板濃度過高引起非特異性擴增增加，影響條帶計數(shù)。DNA量為20 ng時擴增條帶減少。DNA量為30 ng和40 ng時均能獲得清晰可辨、樣式相同的帶型，說明模板的最適用量存在一個區(qū)間，在該區(qū)間內(nèi)模板濃度變化對擴增結(jié)果影響不大。試驗中由于模板質(zhì)量存在一定差異，為保證每次都能得到清晰的條帶，本次試驗選用較高的模板濃度，即 40 ng·20 μL-1。

3.2.2 引物濃度對ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響

引物濃度是影響ISSR-PCR結(jié)果的重要變量之一，濃度過低不能產(chǎn)生有效擴增以檢測出所有ISSR位點，濃度過高會引起錯配和非特異性擴增形成背景使條帶不清晰，且可增加引物之間形成二聚體的幾率(林萍，張含國，2005)。本試驗設(shè)定0.5 μmol·L-1、0.6 μmol·L-1、0.7 μmol·L-1和 0.8 μmol·L-1等4個梯度進行擴增，結(jié)果如圖6所示:

圖6 引物濃度梯度對比

由圖6知，當引物濃度為0.5 μmol·L-1～0.6 μmol·L-1時，反映穩(wěn)定、帶型好、條帶清晰;隨著引物濃度升高到0.7 μmol·L-1時，雖條帶數(shù)目增多，但大片段條帶不清晰。為了減少非特異性擴增，加強試驗的可重復性，試驗在確保產(chǎn)量的前提下，采用了較低的引物濃度，即20 μL反應(yīng)體積中加入引物濃度為 0.6 μmol·L-1。

3.2.3 Mg2+濃度對ISSR擴增結(jié)果的影響

Mg2+濃度對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，Mg2+作為Taq酶的輔助因子，不僅影響Taq酶的活性，還能與反應(yīng)液中的dNTP、模板DNA及引物結(jié)合，影響引物與模板的結(jié)合效率、模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度以及產(chǎn)物的特異性和引物二聚體的形成(姜靜，楊傳平，2003)。本試驗設(shè)定1 mmol·L-1.0、1 mmol·L-1.5、2 mmol·L-1.0 mmol·L-1和2.5 mmol·L-1等4個濃度梯度進行擴增，所得結(jié)果如圖7所示:

圖7 Mg2+濃度梯度實驗

由圖7可見，當其濃度在1.0 mmol·L-1，1.5 mmol·L-1，2.0 mmol·L-1和 2.5 mmol·L-1時均能得到清晰的條帶，但其濃度過高或過低擴增帶都較少，濃度過低降低了Taq DNA聚合酶的活性使產(chǎn)物減少;濃度過高引起與反應(yīng)液中的dNTP、模板DNA及引物結(jié)合，同樣使條帶減少。Mg2+濃度在2.0 mmol·L-1時條帶多、帶型好且條帶清晰容易區(qū)分，經(jīng)多次試驗結(jié)果穩(wěn)定。所以確定2.0 mmol·L-1為Mg2+最佳反應(yīng)濃度。

3.2.4 Taq DNA聚合酶濃度對ISSR擴增結(jié)果的影響

Taq酶的用量直接影響擴增的質(zhì)量和實驗成敗，酶用量過高不僅增加成本，還會造成非特異性的擴增產(chǎn)物;濃度過低則會使酶過早地消耗完，合成效率下降而使擴增產(chǎn)物量減少(李鵬等，2008)。本試驗設(shè)定0.5 U、0.75 U、1 U和1.25 U等4個濃度梯度進行PCR擴增，結(jié)果如圖8所示:

圖8 Taq DNA聚合酶濃度對比

試驗結(jié)果表明，Taq DNA聚合酶單位為0.5 U～0.75 U時酶量過低，產(chǎn)物的合成效率低，條帶數(shù)量少;Taq DNA聚合酶單位為1.0 U時可以得到清晰的條帶，無非特異擴增;當其用量升高到1.25 U時出現(xiàn)非特異擴增而使條帶粘連在一起。因此，在思茅松胚乳ISSR-PCR試驗中，確定Taq DNA聚合酶的用量為1 U，經(jīng)多次試驗驗證擴增結(jié)果穩(wěn)定。

3.2.5 dNTPs濃度對ISSR擴增結(jié)果的影響

dNTPs是反應(yīng)的原料，其濃度與PCR擴增效率有密切關(guān)系，濃度過高，會導致聚合酶錯誤地摻入，影響擴增的特異性和準確性，同時還會與Taq DNA聚合酶競爭Mg2+，使反應(yīng)體系中的Mg2+總量下降，從而影響聚合酶的活性;濃度過低，會因dNTP過早消耗而使產(chǎn)物單鏈化，影響擴增效果(余艷等，2003)。本試驗設(shè)置了 0.1 mmol·L-1、0.2 mmol·L-1、0.3 mmol·L-1、0.4 mmol·L-1等 4 個濃度梯度，擴增結(jié)果如圖9所示:

圖9 dNTPS濃度梯度實驗

試驗結(jié)果表明，在0.1 mmol·L-1～0.4 mmol·L-1范圍內(nèi)均可以擴增出條帶，但濃度過高或過低條帶都較少且模糊，不利于多態(tài)性分析。當dNTPs濃度在0.20 mmol·L-1時條帶多且最為清晰，經(jīng)多次試驗表明結(jié)果穩(wěn)定性好。所以dNTPs的用量確定為 0.2 mmol·L-1。

3.3 思茅松ISSR-PCR反應(yīng)擴增體系的建立

通過上述單因子試驗確定了思茅松ISSR-PCR反應(yīng)體系中各影響因子的最適濃度，將各影響因素綜合建立思茅松 ISSR-PCR反應(yīng)體系為:模板DNA40 ng，引物(20 μmol· L-1)0.6 μL，MgCl2(2.5 mmol·L-1)1.6 μL，TaqDNA 聚合酶(5 U·μL-1)1 U，NTPs(2.5 mmol·L-1)1.6 μL，10 ×PCR buffer2 μL，ddH2O14.5 μL。

3.4 ISSR-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定性檢驗

利用引物的篩選結(jié)果，并結(jié)合劉娜等(劉娜，2009)在云南松胚乳中優(yōu)化的ISSR-PCR反應(yīng)體系中的熱循環(huán)程序，即94℃預變性5 min，94℃變性45 s，52℃退火 45 s，72℃ 延伸 60 s，72℃ 終延伸 10 min，循環(huán)35次，用上述篩選出的引物對所有供試樣品進行擴增，從而對上述優(yōu)化的ISSR-PCR反應(yīng)體系進行穩(wěn)定性檢驗。采取同一引物對不同樣品及同一樣品采用不同引物檢測其擴增效果。如圖10、11和12所示:

圖10 ISSR10引物對1號高產(chǎn)脂1號～24號樣擴增效果圖

圖11 ISSR10引物對7號低產(chǎn)脂1號～24號樣擴增效果圖

圖12 ISSR7引物對7號低產(chǎn)脂1號～24號樣擴增效果圖

從圖10、11和12可看出，無論是同一引物對不同樣品還是同一樣品采用不同引物的擴增都能得到條帶清晰、多態(tài)性好的擴增產(chǎn)物。對于個別樣品的條帶缺失，則可能由于引物的原因引起，與擴增體系無關(guān)。試驗結(jié)果表明所建反應(yīng)體系適合思茅松ISSR-PCR擴增，可用于其遺傳圖譜的構(gòu)建。

4 結(jié)論

通過采取SDS和CTAB兩種方法對思茅松胚乳進行DNA提取并比較。結(jié)果表明，CTAB法所得DNA純度較高但產(chǎn)量較低;兩種方法在去除蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)污染上效果相似且都存在一定的降解;將兩種方法所得DNA進行PCR擴增，顯示SDS法優(yōu)于CTAB法。通過優(yōu)化模板DNA用量，Taq DNA聚合酶濃度，Mg2+離子濃度，dNTP濃度、引物濃度等影響因子，確定思茅松ISSR-PCR反應(yīng)體系為:在 20 μl的反應(yīng)體系中，模板 DNA(ng·20 μL-1)40 ng，引物(20 μmol·L-1)0.6 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)1.6 μL，TaqDNA 聚合酶(5 U·μL-1)1 U，dNTPs(2.5 mmol·L-1)1.6 μL，10 ×PCR buffer 2 μL，ddH2O 14.5 μL。通過篩選出的 4個引物對所建體系進行驗證，結(jié)果均表明所建體系穩(wěn)定性高，所得條帶清晰、多態(tài)性好，可用于思茅松ISSR-PCR擴增。

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