胡剛?cè)~，萇生科，莊金山，白朝勇，張許科，

(1.河南農(nóng)業(yè)大學動物傳染病與微生物實驗室，鄭州 450002;2.國家獸用藥品工程技術研究中心，河南洛陽 471000)

豬瘟病毒(CSFV)的E2基因編碼的蛋白是引起動物機體產(chǎn)生保護性免疫的主要抗原蛋白［1］。目前已被批準生產(chǎn)的豬瘟標記疫苗是Advasure?(Pfizer，UK)和 Porcilis Pesti? (Intervet，the Netherlands)［2］，二者均是以豬瘟病毒E2蛋白為基礎開發(fā)的亞單位疫苗，可以很容易通過檢測其它相關抗體來區(qū)別免疫豬和感染豬。

桿狀病毒表達系統(tǒng)是一種高效的真核表達系統(tǒng)，能夠有效進行蛋白質(zhì)的翻譯后加工，如轉(zhuǎn)運、分泌、糖基化、脂?；龋浔磉_的外源蛋白結構與天然蛋白結構非常接近。近年來，通過家蠶幼蟲和蠶蛹感染重組桿狀病毒表達外源蛋白的方法成功地應用于一些蛋白的表達，外源蛋白的表達量得到大幅提高。周耐明等［3］利用重組的家蠶核型多角體病毒(BmNPV)在家蠶幼蟲和蠶蛹中高效表達了具有生理活性的 HBsAg，表達量高達750 μg/蠶。肖慶利等［4］利用重組的BmNPV在家蠶幼蟲中高效表達了禽馬立克氏病毒糖蛋白B抗原，每1 mL蠶血淋巴表達量可達1 mg。

本文利用苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)Bac-to-Bac表達系統(tǒng)構建了含有CSFV E2基因的重組AcNPV。重組病毒感染昆蟲細胞后通過分泌途徑產(chǎn)生重組CSFV E2蛋白，在家蠶蛹中亦成功表達出CSFV E2蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料 豬瘟活疫苗購自哈爾濱維科生物技術開發(fā)公司(生產(chǎn)批號:2010005);AcNPV Bac-to-Bac表達系統(tǒng)試劑盒、pFastBacHBM-TOPO載體、DH10Bac感受態(tài)細胞均為Invitrogen公司產(chǎn)品;Sf9細胞由國家獸藥工程技術研究中心保存;QIAamp Viral RNAMini Kit由QIAgen公司生產(chǎn);小量質(zhì)粒提取試劑盒、小量膠回收試劑盒均由天根生化科技有限公司生產(chǎn);AMV反轉(zhuǎn)錄酶、高保真DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、RNA酶抑制劑、T4 DNA連接酶等均由大連寶生物工程有限公司生產(chǎn);DAB顯色試劑盒由康為世紀生物科技有限公司生產(chǎn);CSFV陽性豬血清由國家獸用藥品工程技術研究中心提供;5日齡蠶(品種為大造)由國家獸用藥品工程技術研究中心生物制品研究所實驗動物房提供。

1.2 引物 根據(jù)GenBank登錄的豬瘟病毒C-株的cDNA序列(HM175885)，利用DNAStar軟件設計兩對引物用于擴增豬瘟E2基因。引物由上海英濰捷基生物技術公司合成，其序列如下:

其中引物C6EU的5’端引入了BamH I位點，引物C6ED引入了Hind III位點。

根據(jù)設計，EHU/EHD引物對理論上應擴增出豬瘟病毒E2基因大小為1026 bp;C6EU/C6ED引物對理論上應擴增出豬瘟病毒E2基因大小為1113 bp，該引物對擴增產(chǎn)物包含豬瘟病毒E2基因5’端的內(nèi)源性信號肽序列，加上引物上的酶切位點及末端序列后PCR擴增產(chǎn)物大小應為1133 bp。

1.3 RT-PCR擴增目的基因 將豬瘟活疫苗用稀釋液稀釋后，按照QIAamp Viral RNAMini Kit說明書步驟進行豬瘟病毒RNA的制備，然后分別利用引物EHD和引物C6ED做為反轉(zhuǎn)錄引物進行cDNA的制備。反轉(zhuǎn)錄體系如下:病毒RNA 10.5 μL，反轉(zhuǎn)錄引物(10 pmol/L)1 μL，RNA 酶抑制劑0.5 μL，dNTPs 2 μL(2.5 mmol/L)，反轉(zhuǎn)錄酶 1 μL(5 U)，反轉(zhuǎn)錄酶 Buffer 4 μL，總體系為 20 μL，在PCR儀中進行42℃作用1 h。然后在進行PCR反應，PCR 反應總體系為 50 μL:cDNA 模板 3 μL，上下游引物各(10 pmol/L)1 μL，dNTP 4 μL(2.5 mmol/L)，高保真 DNA聚合酶 1 μL，高保真 DNA聚合酶 Buffer 5 μL，用 ddH2O 補足至 50 μL。引物對EHU/EHD的PCR擴增程序為:95℃預變性3 min;95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min 20 s，共進行30個循環(huán);72℃延伸10 min，PCR擴增產(chǎn)物命名為PCR-E2。C6EU/C6ED引物對的PCR擴增程序為:95℃預變性3 min;95℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共進行30個循環(huán);72℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物命名為PCR-C6E2。擴增完成后，取全部擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果大小與目的基因大小一致時，切膠，按照膠回收試劑盒步驟進行PCR產(chǎn)物的回收。

1.4 重組桿狀病毒的獲得 按照AcNPV Bacto-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)操作說明書步驟，將引物對EHU/EHD擴增的產(chǎn)物PCR-E2直接克隆入pFastBacHBM-TOPO載體中，克隆產(chǎn)物命名為pFast-E2;將引物對C6EU/C6ED擴增的PCR產(chǎn)物PCR-C6E2通過 BamH I和 Hind III克隆入pFastBacI中，克隆產(chǎn)物命名為 pFast-C6E2。然后，將重組供體質(zhì)粒pFast-E2和pFast-C6E2分別轉(zhuǎn)化入DH10Bac感受態(tài)細胞中，通過藍白斑篩選出陽性重組的桿狀病毒基因組質(zhì)粒(Bacmid)，并分別命名為Bacmid-E2和Bacmid-C6E2，然后將Bacmid-E2和Bacmid-C6E2轉(zhuǎn)染至Sf9細胞，同時也將Bacmid空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Sf9細胞做為對照病毒。轉(zhuǎn)染后觀察細胞，待50%左右的細胞出現(xiàn)病變后收獲培養(yǎng)上清，通過AcNPV Bac-to-Bac表達系統(tǒng)試劑盒中提供的引物對M13F/M13R擴增特異性片段鑒定重組病毒，重組病毒的PCR擴增產(chǎn)物大小應約為2300 bp加上目的基因的大小，不含有目的基因的對照病毒PCR擴增產(chǎn)物大小約為300 bp。PCR反應總體系為50 μL:病毒基因組模板 3 μL，M13F/M13R(10 pmol/L)各 1 μL，dNTP 4 μL(2.5 mmol/L)，高保真 DNA 聚合酶 1 μL，高保真 DNA聚合酶 Buffer 5 μL，用 ddH2O補足至50 μL。PCR擴增程序為:95℃預變性3 min;95℃變性30 s，55 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 5 min，共進行30個循環(huán);72℃延伸10 min。獲得的重組病毒分別命名為VBac-E2和VBac-C6E2，對照病毒命名為VBac。

1.5 重組病毒在Sf9細胞中表達CSFV E2的鑒定間接免疫熒光鑒定重組蛋白:以M.O.I.=10感染生長至80%左右的單層Sf9細胞，感染48 h后用PBS(0.01 mol/L pH7.4)洗滌細胞 3 次，冷甲醇固定10 min，用含有1%BSA的PBS封閉30 min，PBS洗滌細胞3次，每次5 min，加入CSFV陽性豬血清于37℃溫箱孵育1 h，再用PBS洗滌3次，每次5 min，加入異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標記的羊抗豬 IgG二抗37℃孵育45 min，再用PBS洗滌3次，每次5 min，然后置于倒置熒光顯微鏡下觀察結果。

ELISA法鑒定重組蛋白:按照韓國金諾公司豬瘟抗原檢測試劑盒說明書進行。以M.O.I.=10感染生長至80%左右的單層Sf9細胞，感染后48、60、72和84 h分別收獲細胞培養(yǎng)上清，進行ELISA檢測培養(yǎng)上清中的重組蛋白。

1.6 重組蛋白在家蠶蠶蛹中表達 將獲得的轉(zhuǎn)蛹3 d后的蠶蛹通過微量注射器進行蠶蛹體節(jié)之間皮下注射，挑選40只蠶蛹進行隨機分成5組，第1組5只蠶蛹，每只注射0.01 mol/L的pH6.4的 PBS 2.5 μL，做為 PBS對照組;第 2 組 10 只蠶蛹，每只注射2.5 μL 濃度為 2.5 ×105PFU/μL 的 VBac-E2重組病毒液;第3組10只蠶蛹，每只注射2.5 μL濃度為2.5×105PFU/μL的 VBac-C6E2重組病毒液;第4組10只蠶蛹，每只注射2.5 μL濃度為2.5×105PFU/μL的VBac對照病毒液;第5組5只蠶蛹，不注射，做為空白對照組。注射后第7天收獲蠶蛹血淋巴，凍存于-20℃，備用。

1.7 Western-blot鑒定蠶蛹血淋巴中重組蛋白的表達 將收集的蠶蛹血淋巴進行SDS-PAGE電泳，將膠塊上的蛋白條帶經(jīng)電轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用含有5%脫脂奶粉的PBST封閉過夜，以CSFV陽性豬血清作為一抗，37℃孵育1 h，PBST洗滌硝酸纖維素膜3次，每次5 min，以辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG作為二抗，37℃孵育1 h，然后用DAB顯色試劑盒進行顯色，并進行拍照記錄結果。

2 結果

2.1 RT-PCR擴增目的基因 RT-PCR產(chǎn)物PCR-E2和PCR-C6E2通過核酸凝膠電泳鑒定，結果如圖1所示，獲得了與預期大小一致的DNA條帶(1026 bp和1133 bp)。

圖1 RT-PCR擴增目的基因

2.2 重組桿狀病毒的鑒定 將重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-E2、Bacmid-C6E2和Bacmid空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Sf9細胞后，在轉(zhuǎn)染后72～96 h觀察到三種桿狀病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞均出現(xiàn)細胞病變。通過引物對M13F/M13R對細胞培養(yǎng)上清進行PCR鑒定，結果(圖2)顯示重組病毒構建成功。

圖2 重組桿狀病毒的鑒定

2.3 重組病毒在Sf9細胞中表達CSFV E2的鑒定間接免疫熒光鑒定重組病毒在感染后48 h后的Sf9細胞中重組蛋白的表達情況。在VBac-E2和VBac-C6E2感染的Sf9細胞中能觀察到熒光，而VBac感染的Sf9細胞中沒有觀察到熒光，結果表明，重組病毒VBac-E2和VBac-C6E2感染Sf9細胞后均能夠表達CSFV E2蛋白。

為了進一步驗證重組蛋白是否能分泌表達，對感染Sf9細胞48、60、72和84 h后的培養(yǎng)上清進行ELISA檢測，樣品在450 nm波長下的OD值結果如表1。

根據(jù)試劑盒結果判定標準，當樣品OD值≥0.4375時應判定為陽性，表1中結果顯示，重組病毒VBac-E2和VBac-C6E2在感染Sf9細胞后48、60、72和84 h的細胞上清中重組蛋白檢測結果均為陽性，對照病毒VBac感染Sf9細胞84 h后細胞上清中重組蛋白檢測結果為陰性。結果表明，重組病毒VBac-E2和VBac-C6E2在感染Sf9細胞后能夠分泌表達CSFV E2蛋白。

表1 重組蛋白的ELISA檢測

2.4 重組蛋白在家蠶蠶蛹中表達及Western-blot鑒定 按照材料與方法1.6中所述進行蠶蛹注射重組病毒，在注射后發(fā)現(xiàn)注射重組病毒及對照病毒的蠶蛹的體色變暗甚至發(fā)黑，而PBS對照組和空白對照組則體色變化較小或無變化。于注射后第7天收獲蠶蛹血淋巴進行Western-blot鑒定重組蛋白的表達，結果顯示，重組病毒VBac-E2和VBac-C6E2注射蠶蛹組血淋巴在45～60 kD之間，靠近45 kD條帶(圖3)，與預期大小相符(約48 kD)。

圖3 Western-blot鑒定蠶蛹中重組蛋白的表達

3 討論

本研究構建了兩株重組病毒VBac-E2和VBac-C6E2。其中，在 VBac-E2中 CSFV E2基因通過供體質(zhì)粒pFastBacHBM-TOPO載體而引入了蜂毒素信號肽序列，目的想通過蜂毒素信號肽的引導來分泌表達CSFV E2蛋白。研究結果表明，蜂毒素信號肽能夠引導CSFV E2的分泌表達。重組病毒VBac-C6E2中，目的基因5’端存在CSFV的內(nèi)源信號肽序列，試驗表明內(nèi)源性信號肽同樣能夠引導CSFV E2的分泌表達。

有文獻報道認為AcNPV經(jīng)口或皮下注射不感染家蠶［5-6］，但也有報道稱AcNPV能感染特殊品種的家蠶［7-8］。本研究通過注射感染大造蠶蛹進行目的蛋白的表達，Western-blot分析結果表明重組AcNPV能夠在大造蠶蛹中表達CSFV E2蛋白。

桿狀病毒表達系統(tǒng)進行外源蛋白表達過程中的轉(zhuǎn)錄翻譯和翻譯后修飾加工等與動物細胞相似，表達的外源蛋白活性與天然蛋白基本一致［9］。而家蠶生物反應器表達重組蛋白，外源蛋白的表達量和生物活性更好，成本更低［10］。與傳統(tǒng)重組BmNPV的構建相比，重組AcNPV的構建操作更簡單，技術更成熟。家蠶并非AcNPV的天然宿主，通過注射感染家蠶蛹的癥狀更輕微，不易造成致死性的病理變化，可能更有利于家蠶生物反應器表達重組蛋白的應用。利用引物對M13F/M13R對重組病毒進行鑒定時，在預期大小位置處出現(xiàn)了特異性條帶，但也存在一些非預期大小的條帶，這可能是由于PCR擴增時較低的退火溫度所致，也可能是由于細胞培養(yǎng)上清中存在較多的雜蛋白，引起引物非特異性結合所致。

雖然，本研究利用重組AcNPV在蠶蛹中成功表達了CSFV E2蛋白，但蠶蛹感染重組病毒的方式、重組病毒的感染劑量、重組蛋白的純化工藝、表達量優(yōu)化等一些問題還有待于深入研究。

［1］ Risatti G R，Borca M V，Kutish G F，et al.The E2 glycoprotein of classical swine fever virus is a virulence determinant in swine［J］.J Virol，2005，79(6):3787-3796.

［2］ Blome S，Meindl-B?hmer A，Loeffen W，et al.Assessment of classical swine fever diagnostics and vaccine performance［J］.Rev Sci Tech Off Int Epiz，2006，25(3):1025-1038.

［3］ 周耐明，張 穎，金 偉，等.乙肝病毒S基因在家蠶細胞及蠶體內(nèi)高效表達狀［J］.生物工程學報，1995，32(11):111-115.

［4］ 肖慶利，季 平，何家祿，等.禽馬立克氏病毒糖蛋白B基因在家蠶中的表達［J］.蠶業(yè)科學，1997，23(2):104-108.

［5］ Shikata M，Shibata H，Sakurai M，et al.The ecdysteroid UDP-glucosyltransferase gene of Autographa californica nucleopolyhedrovirus alters the moulting and metamorphosis of a non-target insect，the silkworm，Bombyx mori Lepidoptera，Bombycidae［J］.J Gen Virol，1998，79:1547-1551.

［6］ Yamao M，Katayama N，Nakazawa H，et al.Gene targeting in the silkworm by use of a baculovirus［J］.Genes Dev，1999，13:511-516.

［7］ Tingqing Guo，Shengpeng Wang，Xiuyang Guo，et al.Productive infection of Autographa californica nucleopolyhedrovirus in silkworm Bombyx mori strain Haoyue due to the absence of a host antiviral factor［J］.Virology，2005，341:231-237.

［8］ T Q Guo，J Y Wang，X Y Guo，et al.Transient in vivo gene delivery to the silkworm Bombyx mori by EGT-null recombinant AcNPV using EGFP as a reporter［J］.Archives of Virology，2005，150:93-105.

［9］ 吳小鋒，岳萬福，劉劍梅，等.Bac-to-Bac系統(tǒng)的研究進展及在家蠶中的應用［J］.蠶業(yè)科學，2007，33(1):146-150.

［10］楊瑞麗，金勇豐，吳玉澄，等.利用家蠶生物反應器生產(chǎn)有用蛋白的研究［J］.浙江大學學報(農(nóng)業(yè)與生命科學版)，2001，27(2):173-178.