黃澤偉，程江鳳，蔡珊，林美金，盧瑞榮，吳科鋒，李文德，3，*，黃韌

（1.廣東醫(yī)學(xué)院第一臨床學(xué)院，廣東 湛江 524023；2.廣東天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524023；3.廣東醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東 湛江 524023；4.廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所，廣東 廣州 510260）

長(zhǎng)期過量或一次性大量攝入酒精引起的酒精中毒及并發(fā)癥已嚴(yán)重影響了人們的正常生活，據(jù)統(tǒng)計(jì)在歐美國(guó)家，酒精中毒是位列心血管疾病、腫瘤之后占第3位的公共衛(wèi)生問題，美國(guó)一般人群的終生患病率高達(dá)18%，且有超過20%的入院病人是由于濫用酒精致的急性中毒所引起的[1-2]。我國(guó)是酒精的生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，由飲酒引起的酒精中毒患者數(shù)量巨大，因此開發(fā)有效防醉酒、醒酒及護(hù)肝的藥物及保健食品受到醫(yī)藥及食品行業(yè)的普遍重視。蕓香科黃皮屬黃皮（Clausena lansium），果實(shí)具有健脾開胃、行氣解郁之功效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)了其中的有效成分黃皮酰胺有抗衰老、保肝解毒和促智的作用[3-5]。本研究擬通過小鼠酒精中毒動(dòng)物模型觀察黃皮果提取物在防醉及保肝方面的作用,并為將其開發(fā)為解酒護(hù)肝產(chǎn)品提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

健康ICR種小鼠，雌雄各半，體重24 g～28 g，均為清潔動(dòng)物，檢疫合格，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。52°二鍋頭白酒為北京紅星酒業(yè)有限公司產(chǎn)品；752N紫外可見分光光度計(jì)：上海精科；T－500型電子天平：常熟雙杰測(cè)試儀器；臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器公司；ALT、AST、ADH酶試劑盒：南京建成生物工程研究所；酶標(biāo)儀：BIO-TEX ELX800。

1.2 方法

1.2.1 黃皮果提取物的制備

烘干、粉碎后稱取適量黃皮果，分別以60℃和90℃，水煎3次，按1∶1混合，并濃縮成含生藥量1 g/mL供試品備用，用時(shí)分別配成含生藥5、10 g/kg進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 小鼠給酒劑量的選擇

36只ICR小鼠隨機(jī)分為6組，每組6只，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)前禁食12h，自由飲水，實(shí)驗(yàn)時(shí)分別從0.11mL/10g～0.16 mL/10 g不同劑量的白酒（52°紅星二鍋頭）分別對(duì)6組小鼠進(jìn)行灌胃，每組6只。觀察記錄小鼠醉酒數(shù)量。醉酒與否以翻正反射（lost of righting reflex,LOR）是否消失為判斷指標(biāo),小鼠灌酒后,將其背向下輕輕放在動(dòng)物籠內(nèi)，若動(dòng)物背向下的姿勢(shì)保持20 s以上，則認(rèn)為翻正反射消失，即為醉酒，反之為不醉。

1.2.3 黃皮果對(duì)小鼠醉酒的影響

選取小鼠40只，雌雄各半，隨機(jī)分為4組，每組10只,隨機(jī)分成：正常組、模型組、黃皮果提取物低劑量組（生藥5 g/kg）、高劑量組（生藥10 g/kg）。各實(shí)驗(yàn)組給予相應(yīng)的藥物30 min后，空白組灌以等量的生理鹽水,其余各組分別灌胃實(shí)驗(yàn)用酒0.12 mL/10 g，分別記錄小鼠醉酒數(shù)量、攀附時(shí)間（灌服酒后，然后立即將小鼠放在垂直的金屬網(wǎng)上，觀察小鼠活動(dòng)情況并記錄各小鼠攀附在網(wǎng)上的時(shí)間），醉酒潛伏時(shí)間（從灌酒到翻正反射消失的時(shí)間）及持續(xù)醉酒時(shí)間（從翻正反射消失到清醒的時(shí)間）。

1.2.4 生化指標(biāo)檢測(cè)

灌酒6 h后用眶靜脈采血，處死小鼠，3000 r/min離心10 min，分離血清，-20℃冰箱保存，按照試劑盒說明方法檢測(cè)血中ALT、AST、ADH。

1.2.5 肝組織病理變化觀察

處死小鼠后迅速剖腹取出肝臟，取部分肝組織用10%福爾馬林固定36 h后，HE染色，觀察小鼠肝組織形態(tài)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 食用酒精灌胃制備小鼠酒精中毒動(dòng)物模型

不同酒精攝入量對(duì)小鼠醉酒狀況的影響見表1。

表1 不同酒精用量對(duì)小鼠醉酒情況的影響(n=6)Table 1 Effect of different dosage of alcohol on the rate of drunkenness(n=6)

分別給小鼠灌胃白酒 0.11、0.12、0.13、014、0.15、0.16 mL/10 g，記錄30 min內(nèi)小鼠醉酒數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明0.12 mL/10 g組6只全部醉倒而都沒有醉死，因此0.12 mL/10 g為較佳致醉量。

2.2 黃皮果提取物對(duì)酒精中毒小鼠醉酒效果的影響

黃皮果提取物各劑量組防醉結(jié)果見表2。

表2 黃皮果提取物對(duì)小鼠醉酒率、醉酒潛伏時(shí)間、持續(xù)醉酒時(shí)間(n=10)Table 2 Effect of the astract from FCW on the rate of drunkenness,latent time of drunkenness and durative time of drunkenness(n=10)

與模型組相比，灌酒前30 min給予不同濃度的黃皮果提取物,均可降低小鼠醉酒發(fā)生率、延長(zhǎng)攀附時(shí)間及縮短小鼠持續(xù)醉酒時(shí)間，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），盡管給藥組均發(fā)現(xiàn)可明顯延長(zhǎng)小鼠醉酒潛伏時(shí)間，僅高劑量組對(duì)延長(zhǎng)醉酒潛伏時(shí)間的差異有顯著性（P＜0.05）。

2.3 黃皮果提取物對(duì)小鼠血清中ALT、AST、ADH水平的影響

黃皮果提取物各劑量組對(duì)小鼠血清中ALT、AST、ADH水平的影響見表3。

表3 黃皮果提取物對(duì)小鼠血清中ALT、AST、ADH水平的影響(n=10)Table 3 Effect of the extract from FCW on the level of ALT,AST and ADH in serum(n=10)

與正常組相比，模型組ALT和AST水平明顯升高（P<0.05），說明大劑量的酒精攝入可使肝功能受損。黃皮果提取物高、低劑量組與模型組相比均可明顯降低小鼠血清ALT水平（P<0.05），但對(duì)AST的水平影響不明顯，同時(shí)各實(shí)驗(yàn)組均可升高ADH水平且差異有顯著性（P<0.05）。

2.4 黃皮果提取物對(duì)小鼠肝組織病理變化的影響

HE染色光鏡下觀察不同組別小鼠的肝組織形態(tài)的結(jié)果見圖1。

圖1 黃皮果提取物對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷的影響（HE染色×400）Fig.1 Effect of the astract from FCW on the acute liver injury

結(jié)果顯示：正常組小鼠肝細(xì)胞無(wú)明顯變性、壞死，無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組小鼠肝臟可見肝小葉中央靜脈、匯管區(qū)周圍有大量肝細(xì)胞水樣變，肝細(xì)胞脂肪樣變明顯，可見炎細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組相比,黃皮果提取物高劑量組與低劑量組肝細(xì)胞水樣變、脂肪樣變以及炎細(xì)胞浸潤(rùn)均有明顯改善，其中以高劑量組效果更顯著。

3 討論

醉酒狀態(tài)是酒精中毒的一個(gè)特征指標(biāo)，是由于過量攝入乙醇，超過了機(jī)體氧化酒精的速度，而產(chǎn)生的蓄積中毒。目前已證實(shí)乙醇及其代謝產(chǎn)物乙醛具有強(qiáng)烈的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和毒性，嚴(yán)重?fù)p傷肝細(xì)胞及心肌細(xì)胞，導(dǎo)致肝功能及心肌功能下降[6-7]。因此，通過降低乙醇在體內(nèi)的蓄積或加快乙醇在體內(nèi)的代謝可防止酒精中毒的發(fā)生，也是解酒防醉的治療原則。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比，酒前灌黃皮果提取物可顯著降低小鼠醉酒率、持續(xù)醉酒時(shí)間、延長(zhǎng)醉酒潛伏時(shí)間及小鼠的攀附時(shí)間，這說明黃皮果提取物有明顯的防醉效果。

肝損傷的一個(gè)重要標(biāo)志就是生化指標(biāo)的變化，正常肝內(nèi)ALT含量約為血中的100倍，當(dāng)肝臟實(shí)質(zhì)性損害時(shí)，只要有1%的肝細(xì)胞壞死，就可使血清活性增加1倍；當(dāng)細(xì)胞膜通透性增加時(shí)，即使無(wú)壞死，肝細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氨酶也可以順濃度差而釋放入血。因此轉(zhuǎn)氨酶是肝細(xì)胞損害的敏感標(biāo)志，也是乙醇所致肝損傷最敏感的指標(biāo)[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組中ALT比正常組顯著升高，而各劑量黃皮果提取物組可使ALT有明顯的下降，表明對(duì)肝細(xì)胞有保護(hù)作用，這與HE染色觀察到的結(jié)果相符，其中模型組肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯的變性、壞死區(qū)域，而黃皮果提取物低、高劑量組肝細(xì)胞形狀無(wú)明顯變性壞死區(qū)域。而AST則以心肌含量最高，其次為肝臟，只有當(dāng)肝細(xì)胞受到明顯損傷，尤其是線粒體損傷時(shí)才釋放到血中，因此AST提示肝細(xì)胞損傷嚴(yán)重[8]。實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的用藥組AST水平與模型組相比降低不如ALT明顯，是否說明酒精中毒不僅引起肝損傷，同時(shí)也損傷了心肌細(xì)胞導(dǎo)致大量的AST釋放入血，而提取物對(duì)心臟功能無(wú)明顯保護(hù)作用，這需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

乙醇脫氫酶（ADH）是人體分解乙醇的主要酶類，主要分布于肝臟，ADH分解酒精的速度主要與ADH的量有關(guān)[9]，血清中ADH的水平可以反映體內(nèi)酒精代謝的情況，目前大部分解酒藥物也正是基于這一機(jī)制開發(fā)的。與正常組比較，模型組小鼠肝組織ADH活性有所升高，而低、高劑量組與模型組相比的ADH有明顯的上升，表明黃皮果提取物組可以誘導(dǎo)ADH活性增強(qiáng)、促進(jìn)乙醇的代謝,加速乙醇的排除體外,降低血清乙醇濃度。這可能與黃皮果提取物內(nèi)存在能增強(qiáng)ADH活性的相關(guān)物質(zhì)如黃皮酰胺類等，但其相關(guān)機(jī)制尚未明確，需作進(jìn)一步研究。

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