劉陽(yáng)，韋京豫，蒲玲玲，吳健全，楊繼軍，郭長(zhǎng)江

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，天津 300050）

葛根素（puerarin）是從豆科植物野葛、甘葛藤的干燥根中提取出來(lái)的一種異黃酮成分,其化學(xué)名稱為7，4’-二羥基異黃酮-8β-D-葡萄吡喃糖，呈白色針狀結(jié)晶，能溶于水，但溶解度小，其水溶液為無(wú)色或微黃色。它具有改善心腦血管循環(huán)、降低血糖、防止高血壓及動(dòng)脈硬化、提高機(jī)體免疫力、抗菌、抗病毒等多種藥理作用，并具有明顯的解酒和改善學(xué)習(xí)記憶功效[1-4]。葛根素因毒性小,安全范圍廣,療效好而極具臨床應(yīng)用價(jià)值。它常見(jiàn)的測(cè)定方法有：紫外分光光度法（UV）[5]、高效液相色譜法（HPLC）[6]、薄層色譜法（TLC）[7]和毛細(xì)管電泳（CE）[8]等。但應(yīng)用范圍最廣的是HPLC,本實(shí)驗(yàn)采用HPLC方法測(cè)定不同種類食物中葛根素的含量，進(jìn)一步了解葛根素在不同種屬植物中的分布情況。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

葛根素標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)。主要儀器包括2695型高效液相色譜儀、2998型二極管陣列檢測(cè)器：Waters公司；ALPHA1-4/LD-2型冷凍干燥機(jī)：德國(guó)Martin Christ公司。

1.2 樣品采集與處理

1.2.1 樣品采集

共采集60種食物樣品，分別由重慶、廣州、天津、武漢4個(gè)不同地區(qū)提供，主要包括蔬菜、水果及干豆類食物。蔬菜水果樣品用自來(lái)水、蒸餾水反復(fù)沖洗干凈，晾干，按我國(guó)居民食用習(xí)慣將可食用部分（不少于300 g）切成丁塊并混合均勻，冷凍干燥24 h后取出，分裝入鋁箔袋中，抽真空后封口，放入-50℃低溫冰箱中保存，同時(shí)測(cè)算每種樣品的水分含量。干豆類樣品直接用打碎機(jī)研成粉末，分裝入鋁箔袋中，抽真空后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 樣品前處理

分別取食物樣品，將其研制成粉末，精密稱取0.25 g，置于容量為50 mL的離心管內(nèi)，加入水-甲醇（1∶1）混合液20 mL，置于85℃水浴30 min，冷卻后3000 r/min離心10 min，將上清液移置50 mL容量瓶中，殘?jiān)儆盟?甲醇（1∶1）混合液提取兩次，每次加入 15 mL，渦旋震蕩3 min，離心分離，將其上清液并入上述容量瓶中，加水-甲醇（1∶1）混合液至刻度線，作為樣品溶液。每種食物樣品平行取樣處理測(cè)定3次。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精確稱取葛根素對(duì)照品 5 mg，加水-甲醇（1∶1）混合液溶解后配制成10 mL儲(chǔ)存溶液。準(zhǔn)確量取該液1 mL，置入 25 mL 容量瓶中，加水-甲醇（1∶1）混合液至刻度，作為標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液。

1.3 色譜條件

方法[9]，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室條件確定如下：色譜柱：Waters Nova-Pak C18（4μm,3.9 mm×150 mm）；流動(dòng)相：水-乙腈-磷酸（900∶100∶1）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：35℃；測(cè)定時(shí)取10μL進(jìn)樣，按上述色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定各溶液中葛根素的峰面積，并由此計(jì)算出樣品中葛根素的含量，測(cè)定結(jié)果（以干重計(jì)）以mg/100 g（dry weight,DW）表示。

2 結(jié)果

2.1 葛根素色譜峰的定性

分別取葛根素標(biāo)準(zhǔn)品溶液和葛根樣品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)葛根素的保留時(shí)間為6.2 min左右，將葛根素標(biāo)準(zhǔn)品與葛根樣品的HPLC圖譜進(jìn)行疊加，如圖1。

圖1 葛根素標(biāo)準(zhǔn)品與葛根樣品HPLC圖譜疊加Fig.1 HPLC chromatogram map overlay of puerarin radix puerariae sample

樣品中葛根素的出峰時(shí)間與其完全吻合，表明樣品中葛根素得到很好的分離，色譜峰形佳，干擾峰少且無(wú)拖尾現(xiàn)象。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取葛根素標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，加水-甲醇（1∶1）混合液溶解后，配制成濃度為 3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/mL的溶液，分別取上述溶液各10μL進(jìn)樣，在上述色譜條件下分析，記錄色譜峰面積，在3.125μg/mL～100μg/mL的濃度范圍內(nèi)，色譜峰面積與葛根素濃度呈良好的線性關(guān)系，見(jiàn)圖2?；貧w方程為y=39796x-5306.9，R2=0.9998。

圖2 葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of puerarin

2.3 樣品含量的測(cè)定

2.3.1 葛根中葛根素含量的測(cè)定

按照樣品前處理方法配制葛根樣品溶液，取10μL進(jìn)樣，平行測(cè)定3次，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算葛根素含量。經(jīng)測(cè)定，產(chǎn)自天津的葛根樣品中葛根素含量（以干重計(jì)）為（170.30±1.13）mg/100 g。

2.3.2 蔬菜中葛根素含量的測(cè)定

共測(cè)定了采集于不同地區(qū)的40種蔬菜樣品，包括鮮豌豆、蜜豆、花豆角、刀豆、四季豆、豌豆苗、黃豆苗、藕、紅薯、粉蓮藕、紅心番薯、紫甘薯、紅甘薯、南瓜、生姜、豇豆、扁豆、毛豆、荷蘭豆、綠豆芽、黃豆芽、芋頭、山藥、土豆、白蘿卜等。測(cè)定結(jié)果顯示，只在6種蔬菜中檢出葛根素，其余樣品均未檢出。其中芋頭中葛根素含量最高，為18.60 mg/100 g（以干重計(jì)），遠(yuǎn)高于其它蔬菜；重慶地區(qū)共有4種蔬菜檢出葛根素，而武漢地區(qū)蔬菜樣品均未檢出。不同地區(qū)綠豆芽中均檢出葛根素，其中廣州地區(qū)綠豆芽中葛根素含量（以干重計(jì)）為0.79 mg/100 g，而重慶地區(qū)綠豆芽中葛根素含量（以干重計(jì)）為 0.58 mg/100 g（表 1）。

表1 不同地區(qū)蔬菜（干重）中葛根素含量(mg/100 g，，n=3)Table 1 Puerarin content in vegetables from different areas

表1 不同地區(qū)蔬菜（干重）中葛根素含量(mg/100 g，，n=3)Table 1 Puerarin content in vegetables from different areas

2.3.3 水果中葛根素含量的測(cè)定

共檢測(cè)了10種水果樣品，包括蘋(píng)果、梨、臍橙、西瓜、水蜜桃、草莓、芒果、獼猴桃、香蕉、巨峰葡萄，但只在重慶芒果中檢出葛根素，含量（以干重計(jì)）為（0.97±0.09）mg/100 g。說(shuō)明葛根素在水果中分布較少，含量也偏低。

2.3.4 干豆類食物中葛根素含量的測(cè)定

共測(cè)定了10種干豆類食物樣品，包括花豆、黃豆、綠豆、青豆、蠶豆、豌豆、黑豆、白蕓豆、紅蕓豆、赤小豆。結(jié)果顯示，葛根素在干豆類食物中分布也較少，只在天津綠豆中檢出葛根素，含量（以干重計(jì)）為（1.99±0.07）mg/100 g。

3 結(jié)論

根據(jù)《中國(guó)藥典》2005年版，關(guān)于葛根藥材中葛根素的含量測(cè)定方法是以甲醇-水（25∶75）作為流動(dòng)相[10]，其葛根素的吸收峰與隨后的小雜峰的分離效果不好,出現(xiàn)尖峰還有拖尾現(xiàn)象，且出峰時(shí)間較晚[11]。本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)方法[9]，流動(dòng)相采用水-乙腈-磷酸（900∶100∶1）體系，結(jié)果在此條件下葛根素峰形尖銳且對(duì)稱，原因可能是葛根素含有酚羥基，容易解離，加入酸可以抑制酚羥基的解離，也有效防止了拖尾現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)方法操作簡(jiǎn)便，可應(yīng)用于食物或中藥材中葛根素含量的測(cè)定。

以往文獻(xiàn)多是對(duì)中藥材及飲片中葛根素含量的報(bào)道，而未見(jiàn)對(duì)食物中葛根素含量測(cè)定的報(bào)道，本研究豐富了這方面的數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，除葛根中含有豐富的葛根素外，一些食物中也含有一定量的葛根素，如芋頭，含量（以干重計(jì)）達(dá)18.60 mg/100 g，遠(yuǎn)高于其它樣品；廣州、重慶地區(qū)綠豆芽均檢出葛根素，含量（以干重計(jì)）范圍在0.58 mg/100 g～0.79 mg/100 g。水果樣品只在芒果中檢出葛根素，含量（以干重計(jì)）為0.97 mg/100 g。干豆類樣品也只在綠豆中檢出葛根素，含量（以干重計(jì)）為1.99 mg/100 g?？傮w上看，葛根素在不同種類食物中分布范圍不廣，主要分布在豆科類植物中，且含量也普遍較低。

參考文獻(xiàn)：

[1]Lamlertkittikul S,Chandeying V.Efficacy and safety of Pueraria mirifica(Kwao Kruea Khao)for the treatment of vasomotor symptoms in perimenopausal women:phase II study[J].J Med Assoc Thai,2004,87:33-40

[2]姚新生,趙守訓(xùn),潘得濟(jì),等.天然藥物化學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1996:191-195

[3]久保道德.葛根的化學(xué)成分[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)中醫(yī)中藥分冊(cè),1995,15(3):23-25

[4]孫長(zhǎng)顥.營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)[M].6版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2007:110-121

[5]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(試行)[S].WS-257(X-207)-92[6]顏軍,胡靜,陳啟蒙.HPLC法測(cè)定注射用葛根素中葛根素含量[J].天津藥學(xué),2008,20(4):26-28

[7]李云霞.薄層掃描法測(cè)定葛根藥材中葛根素含量[J].中成藥,2001,23(6):444

[8]Han S.Determination of puerarin by capillary electrophoresis with chemiluminescence detection[J].J Chromatogr B,2009,877:1591-1594

[9]王慕鄒.常用中草藥高效液相色譜分析[M].北京:科學(xué)出版社,1999:354-357

[10]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典(2005年版一部)[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:233-234

[11]阮洪生.高效液相色譜法測(cè)定葛根素注射液中葛根素的含量[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐,2006,20(4):46-47