劉旸，張海英，劉國(guó)紅，張宏偉,2，張霞,2,*

（1.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津 300461；2.天津科技大學(xué)，天津 300457）

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）（L.mon）簡(jiǎn)稱單增李斯特氏菌，是一種重要的人獸共患病病原體，感染人和多種動(dòng)物，引起人和動(dòng)物腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)等癥狀。該菌也是一種最為常見(jiàn)的食源性病原菌，WHO將其列為20世紀(jì)90年代食品中四大致病菌之一。它在自然界中分布廣泛，4℃的環(huán)境中仍可生長(zhǎng)繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一，極易污染食品而引起食物中毒和李氏桿菌病的暴發(fā)，尤其是在歐美國(guó)家經(jīng)常發(fā)生[1-3]，給人類的健康及畜牧業(yè)的生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重的威脅，所以建立快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法是保證食品衛(wèi)生安全和有效防治本病的重要手段。

目前對(duì)該菌的檢測(cè)主要有分離培養(yǎng)方法、免疫學(xué)方法[4]及PCR方法[5]等。分離培養(yǎng)法操作步驟繁瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)，一般需要5 d～7 d完成，不能滿足快速檢測(cè)的要求[6]，免疫學(xué)方法具有操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)通量大的優(yōu)點(diǎn)，但是由于該菌與同屬異種菌具有交叉抗原，免疫學(xué)方法不能進(jìn)行李斯特氏菌種間特異性鑒定[7]，而且檢測(cè)結(jié)果容易受多種因素影響，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，不能滿足檢測(cè)的要求。PCR方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，但這類方法通常檢測(cè)成本高，需要比較昂貴的PCR儀，對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境和操作者技術(shù)要求也比較高，常引起非特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng),一般需要幾小時(shí),不利于快速檢測(cè)和基層實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。因此，發(fā)展新的快速準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便、成本低廉的檢測(cè)與鑒定單增李斯特氏菌的方法對(duì)于提高食品衛(wèi)生水平、保證食品安全具有重要的意義。

1 材料

1.1 主要材料與試劑

dNTPs (Fermentas),10×Bst buffer(New England Biolabs),Bst DNA polymerase large fragment(New England Biolabs),MgSO4(Sigma),betaine(Sigma)，核酸快速檢測(cè)試紙條（杭州優(yōu)思達(dá)公司）。

菌株采用單增李斯特氏菌10株，包括2株標(biāo)準(zhǔn)菌株、食品中分離出的野生株8株及6株其他李斯特氏菌屬菌株，24株食源性致病菌詳見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)菌株Table 1 Bacterial strains for detection

1.2 主要儀器與設(shè)備

PCR擴(kuò)增儀（Biometra）、離心機(jī)（Eppendorf，5417R）、DNA/RNA/蛋 白 分 析 儀（BHIMUZDA，Bio Specmini）。

2 方法

2.1 DNA的提取及定量

單增李斯特氏菌C53-3為試驗(yàn)菌株，接種于10 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)16 h，取1 mL用于細(xì)菌基因組提取，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA質(zhì)量及純度。

2.2 引物及探針的設(shè)計(jì)

利用單核細(xì)胞增生李斯特氏菌vir R基因序列（accession no.DQ449868.1）設(shè)計(jì)特異性引物及探針為：D1：5 －BIOTIN －GTCGGTCAATTGCAAAGAG；D2：5 －FITC-CTAGCCTGTGCCAAAGCA；D3：5-BIOTINTTATCATGCAAGTGCGAAC；CPR：5-GTCGGTCAATTG CAAAGAGACTTGATTAATATATAATTAGCCGTT；F：5-GTACACAGAAAAGCGCTG；R：5-TAGGCAAGTCATCT TGTTC。

組成兩套擴(kuò)增體系，第一套擴(kuò)增體系為CPR+F+R+D2+D1，第二套擴(kuò)增體系為CPR+F+R+D2+D3。

2.3 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

反應(yīng)體系為：10×ThermoPol buffer 2μL，10 mmol/L dNTP 0.8μL，100 mmol/L MgSO40.8μL，5 mol/L Betaine 2μL，8 U/μL Bst DNA pol 1μL，20μmol/L F/R 0.1μL/0.1μL，10μmol/L CPR 0.8μL，20μmol/L D1/D20.8μL/0.8μL，模板 1μL，ddH2O 補(bǔ)足至 50μL。

反應(yīng)條件：61℃反應(yīng)60 min。

2.4 結(jié)果檢測(cè)

將等溫PCR擴(kuò)增產(chǎn)物滴加在核酸快速檢測(cè)試紙條上，15 min～30 min觀察，在質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)紅色線條，以檢測(cè)區(qū)是否出現(xiàn)紅色線條判斷反應(yīng)結(jié)果陰陽(yáng)性。

2.5 特異性試驗(yàn)及引物篩選

對(duì)表1中菌株核酸樣本應(yīng)用兩套引物探針體系進(jìn)行試驗(yàn)，以篩選一套合適引物及探針，同時(shí)證明該體系是否具有通用性及特異性。

2.6 靈敏度試驗(yàn)

以C53-3為試驗(yàn)菌株，接種于10 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)16 h。（1）取1 mL用于細(xì)菌基因組提取，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA質(zhì)量及純度，進(jìn)行DNA定量靈敏度檢測(cè)。（2）取1 mL做細(xì)菌計(jì)數(shù)，用PBS對(duì)菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋至10-8，取1 mL提取細(xì)菌基因組做實(shí)驗(yàn)?zāi)０濉?/p>

3 結(jié)果與分析

3.1 檢測(cè)體系的篩選及特異性實(shí)驗(yàn)

對(duì)多株標(biāo)準(zhǔn)菌株、來(lái)自各國(guó)樣品中檢測(cè)出的陽(yáng)性野生菌及其他相關(guān)陰性菌（見(jiàn)表1）核酸樣本進(jìn)行試驗(yàn)，進(jìn)行引物的篩選及特異性實(shí)驗(yàn)，以證明檢測(cè)方法是否具有通用性及特異性。

試驗(yàn)結(jié)果表明兩套體系對(duì)于單增李斯特氏菌無(wú)論標(biāo)準(zhǔn)株或野生株檢測(cè)均為陽(yáng)性，其他24株食源性致病菌檢測(cè)均為陰性，但是在針對(duì)李斯特菌屬其他菌種檢測(cè)時(shí)具有差別，第一套體系特異性良好，只在西爾李斯特菌檢測(cè)出現(xiàn)假陽(yáng)性，而第二套體系特異性較差，在威爾李斯特氏菌及綿羊李斯特氏菌檢測(cè)均為假陽(yáng)性。所以后續(xù)靈敏度試驗(yàn)均采用第一套引物檢測(cè)體系。

3.2 靈敏度檢測(cè)

3.2.1 DNA檢測(cè)靈敏度

利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)C53-3 DNA純度為1.672，質(zhì)量34.08μg/mL。用TE對(duì)DNA原液進(jìn)行10倍梯度稀釋至10-6，按照反應(yīng)體系進(jìn)行試驗(yàn)，如圖1所示，當(dāng)DNA稀釋10-1至10-4即濃度至3.4 pg/μL時(shí)檢測(cè)為陽(yáng)性，在檢測(cè)區(qū)可見(jiàn)紅色條帶；稀釋至10-5至10-6更低稀釋濃度時(shí)，檢測(cè)結(jié)果為陰性，在檢測(cè)區(qū)無(wú)條帶顯示，說(shuō)明該方法DNA檢測(cè)靈敏度可達(dá)到100pg/test。

圖1 單增李斯特氏菌DNA靈敏度試驗(yàn)Fig.1 Sensitivity of detecting DNA of L.mon

3.2.2 純菌液靈敏度檢測(cè)

C53-3過(guò)夜菌液計(jì)數(shù)為5.4×108CFU/mL，用PBS對(duì)菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋至10-8即5.4×100CFU/mL，各取1 mL提取細(xì)菌基因組做實(shí)驗(yàn)?zāi)０?，檢測(cè)靈敏度結(jié)果見(jiàn)圖2，10-1至10-5稀釋時(shí)，結(jié)果為陽(yáng)性，在檢測(cè)區(qū)可見(jiàn)紅色條帶；稀釋至10-6至10-8稀釋時(shí)檢測(cè)結(jié)果為陰性，在檢測(cè)區(qū)無(wú)條帶顯示，說(shuō)明該方法菌液檢測(cè)靈敏度達(dá)到102CFU/test。

圖2 單增李斯特氏菌液靈敏度試驗(yàn)Fig.2 Sensitivity of detecting L.mon in pure culture

4 結(jié)論

與傳統(tǒng)檢測(cè)手段相比，分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)能更快，更可靠發(fā)現(xiàn)食品安全隱患，尤其是目前得到廣泛應(yīng)用的等溫?cái)U(kuò)增方法將檢測(cè)提高到一個(gè)新的高度，很好地解決了目前基因檢測(cè)對(duì)儀器的依賴，使得分子生物學(xué)方法在基層及偏遠(yuǎn)經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)得到廣泛使用。

本研究建立的單增李斯特氏菌恒溫?cái)U(kuò)增方法較環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法（LAMP）在檢測(cè)結(jié)果方面有了很好的改善。LAMP如果使用電泳來(lái)觀察，存在交叉污染的可能；如果采用肉眼觀察沉淀或顏色變化，那么陽(yáng)性結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)不能客觀地界定。本研究建立的方法結(jié)合核酸快速檢測(cè)試紙條進(jìn)行檢測(cè)，依據(jù)試紙條上檢測(cè)線的有無(wú)可以明確判定陰陽(yáng)性結(jié)果，其檢測(cè)DNA靈敏度可達(dá)到100pg/test、純菌液靈敏度達(dá)到102CFU/test可滿足樣品增菌后的檢測(cè)需求。雖然本方法在李斯特菌屬檢測(cè)中存在西爾李斯特氏菌檢測(cè)假陽(yáng)性問(wèn)題，但較免疫金標(biāo)試紙條檢測(cè)只能檢測(cè)到李斯特氏菌屬的特異性上已經(jīng)有了很大程度的提高。結(jié)合實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果表明，該方法靈敏度較高，無(wú)漏檢現(xiàn)象，操作簡(jiǎn)便，不需要特殊設(shè)備，特別適合于基層實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)以及樣品的快速篩選檢測(cè)。

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