李捷，鄭曉艷，左蕾蕾，向晉龍，曾凡駿，*

（1.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，四川 成都 610065；2.四川麥力若科技發(fā)展有限責(zé)任公司，四川 成都 610065）

免疫力是人體自身的防御機(jī)制，是識(shí)別和消滅外來侵入異物，處理衰老、損傷、死亡、變性的自身細(xì)胞以及識(shí)別和處理體內(nèi)突變細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的能力。免疫功能過低使機(jī)體不能及時(shí)清除有害的物質(zhì)，對(duì)于入侵的外來物質(zhì)缺乏抵抗力，容易發(fā)生腫瘤和各種病原微生物感染。靈芝孢子是靈芝的生殖細(xì)胞，含有比靈芝更豐富的多糖肽、腺嘌呤核苷、蛋白質(zhì)、酶類、硒元素等特殊成分。

1 材料與方法

1.1 配方原料及功能

1.1.1 靈芝孢子

靈芝孢子具有增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、護(hù)肝、降血脂、降血糖、清除自由基、消炎抗炎等功效。在增強(qiáng)免疫力，抑制腫瘤的藥效方面都超過其母體靈芝[1]。

1.1.2 VC

VC作為營養(yǎng)增補(bǔ)劑，可防治壞血病、齒槽膿漏、貧血、食欲不振以及防治糖尿病的慢性病發(fā)癥、防治感冒和流感、延緩衰老、預(yù)防腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化、皮膚病、中風(fēng)和預(yù)防血管性癡呆和早腦性癡呆的神經(jīng)退化等。

1.2 破壁靈芝孢子粉的制備

1.2.1 滅菌工藝研究

對(duì)未破壁靈芝孢子粉進(jìn)行干熱滅菌、常壓蒸汽滅菌以及高壓蒸汽滅菌的方法考察。通過滅菌后靈芝孢子粉的外觀狀態(tài)及微生物限度作為判定指標(biāo)，以確定合理的滅菌方式及參數(shù)。

1.2.1.1 主要試劑與儀器

營養(yǎng)瓊脂，乳糖膽鹽，氯化鈉，乙醇，0.1 mg/mL齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)液，冰乙酸，高氯酸，5%的香草醛-冰醋酸溶液，0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，0.2%蒽酮硫酸溶液。

AR2130 型電子天平：Ohaus Corp.Pine Brook，NJ，USA.；UV-1100型紫外-可見光分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；DSY-1-4孔型電熱恒溫水浴鍋：北京愛琦霞商貿(mào)中心；01J2003-04型立式壓力蒸汽滅菌筒：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；SP-DJ系列水平凈化工作臺(tái)：上海浦東物理光學(xué)儀器廠；HHB11-420型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海峪麗電子科技有限公司；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：廣州滬瑞明儀器有限公司。

1.2.1.2 方法

稱取4 g未破壁靈芝孢子粉6份作為樣品，分別置于常壓沸水蒸汽中15 min及30 min；高壓滅菌鍋121℃，30 min；80℃烘箱中 1 h及 2 h；75%乙醇中浸泡10 min烘干。得出對(duì)靈芝孢子粉滅菌后無明顯感觀變化且對(duì)破壁工藝無影響的滅菌條件。再將此滅菌條件滅菌后的樣品進(jìn)行微生物指標(biāo)的檢測；條件最合理者再進(jìn)行功效成分的檢測，確定最終滅菌工藝。

1.2.2 破壁靈芝孢子制備工藝流程

計(jì)量稱重→滅菌→干燥→破壁→破壁靈芝孢子粉

1.3 膠囊制劑工藝

1.3.1 粘合劑的選擇

1.3.1.1 主要試劑和儀器

無水乙醇，淀粉，蒸餾水。

AR2130 型電子天平：Ohaus Corp.Pine Brook，NJ，USA.；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：廣州滬瑞明儀器有限公司。

1.3.1.2 實(shí)驗(yàn)方法

稱取20 g破壁靈芝孢子粉，分別以水、80%乙醇、淀粉-水、淀粉-80%乙醇溶液作為粘合劑。在一定粘合劑用量下，考察粘合效果。

1.3.2 膠囊制劑工藝流程

原料→檢測→計(jì)量稱重→混料→制?！稍铩偦臁b填→拋光→內(nèi)包裝→外包裝→檢驗(yàn)→成品入庫

1.4 安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)及功能評(píng)價(jià)

1.4.1 安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)

1）急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)；2）遺傳毒性試驗(yàn)；3）大鼠30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)。

1.4.2 增強(qiáng)免疫力功能評(píng)價(jià)

實(shí)驗(yàn)設(shè) 333、667、1000 mg/kg·bw 三個(gè)劑量組（分別相當(dāng)于人體推薦量的10、20、30倍），對(duì)靈芝孢子膠囊進(jìn)行對(duì)小鼠臟器/體重比值測定，遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，血清溶血素測定，抗體生成細(xì)胞檢測，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)，NK細(xì)胞活性測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 配方用量確定

根據(jù)文獻(xiàn)資料的研究表明，人體服用靈芝孢子粉0.45 g/d～16.2 g/d區(qū)間內(nèi)，具有顯著的提高缺氧耐受力的功能（P<0.05）及很高的安全性。本產(chǎn)品配方中靈芝孢子粉的每日服用量為1.92 g/d，并輔以VC協(xié)同作用，具有良好的增強(qiáng)免疫力的功能。

2.2 破壁靈芝孢子粉的制備

2.2.1 滅菌工藝研究

不同滅菌方法滅菌后靈芝孢子粉的感觀指標(biāo)變化情況見表1。

表1 不同滅菌方法滅菌后靈芝孢子粉的感觀指標(biāo)變化情況Table 1 Sensory indexes of Ganoderma Lucidum Spore Powder after different sterilizations

由表1看出，方法6經(jīng)浸泡后不易烘干且結(jié)塊，不利于破壁，故排除此方法。對(duì)前5個(gè)滅菌方法后的樣品進(jìn)行大腸桿菌定性檢測和菌落總數(shù)的檢測，結(jié)果見表2。

表2 大腸桿菌定性檢測和菌落總數(shù)的測定Table 2 E.coli qualitative tests and the determination of total bacterial colonies

由表2可知，按照方法1、2、3滅菌都能初步達(dá)到相應(yīng)的微生物及感觀要求，考慮到操作的難易程度、能源消耗等因素，初步選定方法1。對(duì)此法滅菌處理后的樣品進(jìn)行全面的微生物指標(biāo)檢測及破壁后的功效成分檢測，檢測結(jié)果如表3和表4所示。

表3 方法1滅菌樣品微生物指標(biāo)檢測結(jié)果Table 3 Microbial test results of method 1

表4 方法1滅菌樣品破壁后功效成分檢測結(jié)果Table 4 Efficacy component test results of method 1 g/100 g

由表3、表4可知：常壓蒸汽15 min（100℃）即可將靈芝孢子粉中微生物有效殺滅滿足產(chǎn)品的微生物指標(biāo)，且滿足感觀要求其功效成分含量要求。

2.2.2 破壁靈芝孢子中試制備

1）滅菌：根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得最佳條件，即溫度為100℃，滅菌時(shí)間設(shè)定為15 min。2）干燥：干燥溫度60℃～70℃，干燥時(shí)間為1 h左右，干燥至物料水分5%左右。3）破壁：SYFM-8 PR型振動(dòng)微粉碎機(jī)碾磨破壁，破壁時(shí)間30 min，產(chǎn)品粒度 5μm，破壁環(huán)境溫度±5 ℃，破壁率≥96.0%。

2.3 膠囊制劑工藝

2.3.1 粘合劑的選擇

破壁靈芝孢子粉未加粘合劑時(shí)，休止角為42.8°，堆密度為0.31 g/cm3。為改善孢子粉的流動(dòng)性，增加其堆密度使裝填量達(dá)到要求。對(duì)粘合劑的選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 粘合劑的選擇Table 5 The choice of adhesives

由表5實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，添加2%淀粉先混料均勻后，再添加80%乙醇作為粘合劑，其休止角和堆密度即可達(dá)到要求，且短時(shí)間易烘干。即產(chǎn)品用量為：每100 kg需淀粉約2 kg，80%乙醇10 kg左右。在此用量下，經(jīng)制粒和總混5 min，物料休止角控制在32°～35°、堆密度0.35 g/cm3～0.40 g/cm3，可見流動(dòng)性得到了明顯的改善，且保證了裝量的穩(wěn)定性能制出符合要求的物料顆粒。

2.3.2 膠囊制劑工藝

2.3.2.1 檢測

對(duì)各原料分別進(jìn)行相應(yīng)的感官、理化、微生物指標(biāo)的檢驗(yàn)，符合要求的則進(jìn)行投料。

2.3.2.2 計(jì)量稱重

稱重時(shí)將易吸潮的物質(zhì)后稱，盡量避免其吸潮。

2.3.2.3 混料

按照產(chǎn)品配方，對(duì)各種原料混合，由于配方VC較少且加入少量淀粉進(jìn)行粘合，混合時(shí)采用等量遞增的原則。

2.3.2.4 制粒

高速攪拌制粒，潤濕劑為80%乙醇溶液，每100千克混料需80%乙醇液約10 kg。

2.3.2.5 干燥

制粒完成后，60℃～70℃下沸騰干燥30 min。

2.4 安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)及功能評(píng)價(jià)

2.4.1 安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)

1）急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)：SD大鼠和KM小鼠的急性經(jīng)口MTD值均大于10g/（kg·bw），按急性毒性分級(jí)屬無毒級(jí)。2）遺傳毒性試驗(yàn)：三項(xiàng)遺傳毒性試驗(yàn)（Ames試驗(yàn)、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)以及小鼠精子畸形試驗(yàn)）結(jié)果無致突變作用。3）大鼠30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)：最高劑量為人體推薦量的105倍。長發(fā)育情況和一般表現(xiàn)良好，體重持續(xù)增長，體態(tài)活潑，大、小便未見異常改變。試驗(yàn)期間未見明顯行為改變和中毒表現(xiàn)。

2.4.2 增強(qiáng)免疫力的功能評(píng)價(jià)

經(jīng)口給予小鼠（Balb/c）333、667、1000 mg/kg·bw劑量（分別相當(dāng)于人體推薦量的10、20、30倍）的靈芝孢子膠囊30 d后進(jìn)行測試。在小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，抗原攻擊24 h后，1000 mg/kg·bw劑量組與對(duì)照組小鼠相比，其足跖腫脹度有顯著性差異（p＜0.05）。在小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，中高級(jí)兩組分別與對(duì)照組小鼠相比，其光密度差值均有顯著性差異（p＜0.01）。在抗體生成實(shí)驗(yàn)中，1000 mg/kg·bw劑量組與對(duì)照組小鼠相比，其抗體生成細(xì)胞數(shù)有顯著性差異（p＜0.01）。在小鼠NK細(xì)胞活性測定實(shí)驗(yàn)中，667、1000 mg/kg·bw劑量組分別與對(duì)照組小鼠相比，其NK細(xì)胞活性率均有顯著性差異（p＜0.01）。據(jù)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)可認(rèn)為靈芝孢子膠囊具有增強(qiáng)免疫力的功能。

3 結(jié)論

以靈芝孢子粉為主要原料，輔以VC研制出靈芝孢子膠囊，配方用量經(jīng)文獻(xiàn)及實(shí)驗(yàn)研究具有增強(qiáng)免疫力的功能。

研究了靈芝孢子粉滅菌最優(yōu)方法及條件：100℃蒸汽滅菌15 min。在此條件下進(jìn)行滅菌，能有效殺滅微生物且功效成分不受影響。對(duì)膠囊制劑工藝中粘合劑進(jìn)行了研究，選擇2%淀粉和80%乙醇作為粘合劑，其休止角和堆密度即可達(dá)到要求，且短時(shí)間易烘干。

產(chǎn)品經(jīng)安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)表明靈芝孢子膠囊安全無毒；經(jīng)功能評(píng)價(jià)表明靈芝孢子膠囊具有增強(qiáng)免疫力的作用。

[1]陳軍輝,吳鳳琪,李文龍,等.靈芝孢子粉與子實(shí)體中三萜類化合物、多糖及重金屬元素的含量比較[J].中國藥房,2008,19(33):2585-2587

[2]顧欣,王芷源,劉耕陶.靈芝孢子粉的藥理研究1:對(duì)動(dòng)物化學(xué)性和過敏性肌炎的保護(hù)作用[J].中藥藥理與臨床,1993,15(2):25

[3]盧振,陳金和,王雨來,等.靈芝的研究及應(yīng)用進(jìn)展[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2003,14(9):577-581

[4]馮道俊.靈芝的化學(xué)成分、功效及藥理作用[J].特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物,2006(8):39-40