張 鋒，吳 芹，石京山，陸遠富，劉 航，劉 杰

(1．遵義醫(yī)學院藥理學教研室暨貴州省基礎藥理重點實驗室，貴州 遵義 563099;2．遵義醫(yī)學院藥學院，貴州 遵義 563099)

近年研究發(fā)現(xiàn)神經炎癥反應在神經系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著非常重要的作用［1］，而小膠質細胞的激活被認為是神經炎癥反應的關鍵所在［2］。因此，抑制小膠質細胞所介導的神經炎癥反應將成為治療神經系統(tǒng)疾病的重要靶點之一?；L丹(Hua Feng Dan，HFD)，創(chuàng)制于1644年，是世界上生產、銷售時間最長的治療腦部疾病的中成藥。目前，化風丹在治療中風偏癱、癲癇、面神經麻痹、帕金森氏病、老年癡呆等腦部疾病有很好的療效［3］。但是有關化風丹的中樞神經藥理作用知之甚少，中外文獻檢索近乎空白。因此，本研究擬采用原代大鼠小膠質細胞培養(yǎng)，通過脂多糖(LPS)誘導小膠質細胞激活引起神經炎癥反應，觀察化風丹對小膠質細胞介導的神經炎癥反應的抑制作用，為其臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實驗動物 Sprague－Dawley(SD)大鼠(第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心，許可證:SCXK2007－017)，♀♂兼用，體重200～250 g。

1．1．2 藥品及試劑 化風丹(貴州萬勝藥業(yè)有限責任公司);LPS(美國Calbiochem公司);細胞培養(yǎng)試劑(美國Invitrogen公司);一氧化氮(NO)檢測試劑盒(江西碧云天生物技術研究所);酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(ELISA)(美國R＆D systems公司);Trizol、RNA純化試劑盒以及所有引物(上海生工生物工程技術服務有限公司)。

1．1．3 儀器設備 超凈工作臺(蘇州精華設備公司);倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司);CO2注入式電熱恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo Electron公司);96孔板清洗儀、酶標儀、PCR儀(美國BIO－RAD公司)。

1．2 方法

1．2．1 原代大鼠小膠質細胞培養(yǎng) 無菌操作條件下取出出生后1 d的SD大鼠幼鼠的全腦，置于Dulbecco＇s minimum essential medium(DMEM)/F12 培養(yǎng)液中。將嗅球和小腦去除，然后剝除腦膜，對剩余腦組織實施機械吹打從而分離細胞。離心之后去除上清，把細胞懸浮在含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中，以6×107個細胞接種到面積為175 cm2的培養(yǎng)瓶中。每4 d更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)至14 d后，星形膠質細胞長滿整個培養(yǎng)瓶底部，而小膠質細胞貼附在星形膠質細胞表面。振蕩培養(yǎng)瓶1 h使小膠質細胞脫離星形膠質細胞而飄浮在細胞培養(yǎng)液中。收集細胞懸液，棄上清，將小膠質細胞按5×105/孔和1×105/孔的密度分別接種于24孔和96孔板中用于細胞相關指標的檢測［4］。

1．2．2 實驗分組及藥物處理 實驗隨機分為空白對照組、化風丹組(0.3 mg/mL)、模型組(10 ng/mL LPS)、LPS+化風丹組(0.03、0.1 和 0.3 mg/mL)。化風丹通過二甲基亞砜(DMSO)溶解，將藥物混懸液用細胞培養(yǎng)液稀釋，實驗所用DMSO濃度(＜0.05%)對細胞未產生任何毒性反應。細胞培養(yǎng)中先加入HFD作用30 min，再加入LPS處理，在不同的時間點進行相應的指標檢測。

1．2．3 NO測定 由于一氧化氮的半衰期極短，很容易形成亞硝酸鹽，所以通過Griess試劑檢測培養(yǎng)液中亞硝酸鹽的含量可以一定程度上反映NO的產生情況。具體步驟如下:將收集的細胞培養(yǎng)上清液與等體積的Griess試劑 (1．0%氨苯磺胺、0．1%萘乙二胺二氫氯化物和2．5%磷酸)混合，室溫下避光反應10 min，通過分光光度計讀取波長540 nm處的吸收值。樣品的亞硝酸鹽濃度根據(jù)亞硝酸鈉配成的標準曲線來確定［5］。

1．2．4 實時反轉錄聚合酶鏈反應試驗 (Realtime RT PCR)通過Real－time RT－PCR檢測小膠質細胞內腫瘤壞死因子α(TNFα)、白介素－1β(IL－1β)和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的表達。采用 Trizol從細胞中提取出總 RNA，通過RNA純化試劑盒將提取出來的RNA純化，在紫外分光光度儀上檢測RNA純度，通過反轉錄酶制備cDNA然后進行 PCR擴增［6］，以 β －actin作為內參，目的基因的結果與內參進行比較，并設置LPS組為100%，計算其余各組基因的相對表達量。引物序列(見表1)。

表1 PCR引物序列

1．2．5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 將試劑盒中的Capture抗體用 PBS進行稀釋，然后加入到ELISA專用96孔板中，室溫過夜后，先用含PBS和0．05%Tween 20的緩沖液漂洗，再用含1%BSA的封阻液封阻。緩沖液漂洗3次，將待測樣品稀釋3倍加入96孔板中，室溫孵育2 h后加入檢測抗體再孵育2 h，漂洗3次，加入生物素蛋白標記的過氧化物酶孵育20 min，緩沖液漂洗3次，加入顯色液孵育20 min，通過硫酸終止反應，在分光光度計上讀取波長450 nm處的吸收值［7］。

1．2．6 統(tǒng)計學分析 實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±s)表示，采用SPSS16．0統(tǒng)計軟件對各組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，以 P＜0.05認為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2．1 HFD對小膠質細胞內 TNFα、IL－1β 和 iNOS mRNA表達的影響 原代大鼠小膠質細胞培養(yǎng)中，先加入HFD作用30 min，再加入LPS處理3 h，收集細胞進行Real－time RT PCR檢測。表2所示，LPS(10 ng/mL)誘導小膠質細胞內TNFα、IL－1β和iNOS mRNA的過度表達。HFD能夠顯著抑制LPS所引起的炎癥因子mRNA的過度表達。

表2 HFD對小膠質細胞內炎癥因子mRNA表達的影響(x±s，n=3)

2．2 HFD對小膠質細胞培養(yǎng)上清液中NO含量的影響 小膠質細胞經過LPS處理24 h之后收集細胞培養(yǎng)上清液檢測上清液中NO的含量。表3所示，LPS(10 ng/mL)顯著增加細胞培養(yǎng)上清液中NO的含量。經過HFD預處理能夠抑制LPS引起的NO含量升高。

2．3 HFD對小膠質細胞培養(yǎng)上清液中TNFα和IL－1β蛋白水平的影響 小膠質細胞經過LPS處理24 h后，檢測細胞培養(yǎng)上清液中TNFα和 IL－1β的蛋白含量。表4所示，LPS(10 ng/mL)明顯刺激小膠質細胞釋放TNFα和IL－1β。HFD能夠明顯減少上清液中TNFα和 IL－1β的釋放。

表3 HFD對小膠質細胞培養(yǎng)上清液中NO含量的影響(x±s，n=3)

表4 HFD對小膠質細胞培養(yǎng)上清液中TNFα和IL－1β蛋白水平的影響(x±s，n=3)，TNF2(pg/mL)2L －1β(pg/mL)。

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)神經炎癥反應被認為是多種神經系統(tǒng)疾病，例如腦外傷、腦中風、阿爾茨海默病、帕金森病以及多發(fā)性硬化癥等疾病的主要誘因之一［8］。而小膠質細胞是神經炎癥反應的關鍵環(huán)節(jié)［2］。小膠質細胞是腦內常駐的免疫細胞，是機體抵御損傷和感染的第一道防線。在生理情況下，它主要起到免疫監(jiān)視、免疫防御和組織修復的作用［9］。當腦損傷或受到炎性刺激時，小膠質細胞被激活同時釋放多種炎性因子和細胞毒性物質，這些神經毒性介質的不斷產生和積累從而決定了周圍神經元的存亡尤其是對神經退行性疾病的發(fā)生和發(fā)展起到關鍵作用［10］。因此，抑制小膠質細胞的激活將成為治療神經炎癥反應導致的神經系統(tǒng)疾病的關鍵所在。

激活的小膠質細胞產生的大量炎性介質不僅進一步誘導細胞內的免疫反應，更重要的是造成神經細胞的變性損傷。在這些炎性介質中，除了活性氧自由基以外，TNFα、IL－1β以及NO都被認為是誘導神經細胞變性死亡的最主要的炎性因子［8］。此外，通過對神經退行性疾病病人尸檢發(fā)現(xiàn)腦內小膠質細胞的激活以及大量炎性因子聚集增加的征象［11］。因此，抑制小膠質細胞釋放的炎性介質將有助于減緩與炎癥相關的神經系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)化風丹能夠抑制小膠質細胞內NO、TNFα和 IL－1β炎性因子的釋放。這一結果與本課題組在原代神經元－膠質細胞共培養(yǎng)體系中發(fā)現(xiàn)化風丹通過抑制小膠質細胞激活以及釋放神經炎性因子從而對多巴胺能神經元產生保護作用相符［12］。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)化風丹能夠抑制LPS誘導的神經炎癥反應，此抑制作用與減少小膠質細胞內炎癥因子的釋放密切相關。通過本研究拓展了化風丹的作用機理，為化風丹的臨床應用提供了基礎藥理學依據(jù)。

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