蘇安祥，馮印，劉杰，王玉華

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

國(guó)外茁霉多糖上游處理研究現(xiàn)狀及進(jìn)展

蘇安祥，馮印，劉杰，王玉華*

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

茁霉多糖（Pullulan）是一種水溶性胞外中性多糖，由真菌出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）發(fā)酵生產(chǎn)的。茁霉多糖在食品工業(yè)、藥品等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，是一種很有前景的多糖，但是大規(guī)模生產(chǎn)的還很少，主要原因有兩個(gè)，一個(gè)是產(chǎn)量低，另一個(gè)是多糖中色素難以除去。綜述茁霉多糖的生產(chǎn)菌種、生物合成機(jī)理，培養(yǎng)條件的最新研究成果，同時(shí)討論了茁霉多糖的應(yīng)用前景和研究熱點(diǎn)。

茁霉多糖；微生物來(lái)源；合成機(jī)理；培養(yǎng)條件

茁霉多糖是由出芽短梗霉生產(chǎn)的一種微生物多糖。它是一種白色粉末，無(wú)味，無(wú)臭，無(wú)毒，極易溶于水，可塑性極強(qiáng)，具有良好的成膜性，膜具有光澤而透明，透氣性較其他高分子膜低，具有更好的阻隔氧氣的性能。茁霉多糖已廣泛應(yīng)于醫(yī)藥、食品、化妝、輕工和石油等領(lǐng)域，是一種非常有前景的新型多糖。但是在發(fā)酵生產(chǎn)中的一個(gè)缺點(diǎn)是產(chǎn)量低并且在發(fā)酵生產(chǎn)中分泌一種黑色素類化合物。另外一個(gè)缺點(diǎn)是，出芽短梗霉隨著發(fā)酵的進(jìn)行，胞外多糖的平均分子量會(huì)減小，黏度降低，并且發(fā)酵液中底物糖用盡后茁霉多糖被分解以維持細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，正是這些問(wèn)題阻礙著茁霉多糖的生產(chǎn)。近年來(lái)引起了國(guó)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，發(fā)表了許多關(guān)于微生物來(lái)源、結(jié)構(gòu)、上游處理、下游加工以及應(yīng)用等方面的文章。本文將對(duì)國(guó)外有關(guān)茁霉多糖生物合成機(jī)理、生產(chǎn)菌種、培養(yǎng)條件的研究現(xiàn)狀和進(jìn)展進(jìn)行回顧和討論。

1 生物合成的機(jī)理研究

茁霉多糖的生產(chǎn)是在對(duì)數(shù)期后期和穩(wěn)定期的前期。Catley[1]首先發(fā)現(xiàn)，在菌絲體轉(zhuǎn)變成酵母狀細(xì)胞形式時(shí)茁霉多糖出現(xiàn)，據(jù)此推斷酵母狀細(xì)胞獨(dú)立負(fù)責(zé)茁霉多糖的加工。有研究證明了這種理論，因?yàn)樵谟欣诮湍笭罴?xì)胞形態(tài)生長(zhǎng)的條件下多糖產(chǎn)量最大。有數(shù)據(jù)顯示溶漲細(xì)胞以及厚膜孢子的形成和茁霉多糖形成是同時(shí)的。Simon等提出，不論菌絲形式細(xì)胞合成何種多糖，都不是茁霉多糖。當(dāng)大量的厚膜孢子出現(xiàn)時(shí)，無(wú)論培養(yǎng)基是何種條件都一直進(jìn)行茁霉多糖的加工。Yurlova等認(rèn)為，菌絲體細(xì)胞形式也可以產(chǎn)生胞外多糖，而Seviour等認(rèn)為多糖生產(chǎn)不和任何形態(tài)的轉(zhuǎn)變相聯(lián)系。Campbell等最近研究顯示，厚膜孢子和溶漲細(xì)胞分泌多糖，但是分生孢子或菌絲體不分泌。有些研究之間是相互沖突的，這可能是因?yàn)樽旅苟嗵堑纳a(chǎn)受多種因素的影響。

研究人員還提出了幾種關(guān)于茁霉多糖是如何加工的理論。關(guān)于各種出芽短梗霉菌株生物合成茁霉多糖的各種性質(zhì)特點(diǎn)的完整論述出版于1981年。Catley[2]在1971年提出一個(gè)類脂是茁霉多糖運(yùn)到細(xì)胞膜外的載體。Lee和Simon等的研究證明了這一觀點(diǎn)。Rho等[3]提出了2個(gè)途徑，一個(gè)是直接由葡萄糖轉(zhuǎn)換，第2個(gè)是從確定的前體轉(zhuǎn)化。Simon等[4]研究提出，茁霉多糖和不溶性多糖都集中在厚膜孢子的外表面上，如圖1。

最外層是密集的多糖層，里面包著一層由葡萄糖和甘露糖通過(guò)β－1，3－糖苷鍵連接而成的不溶性的多聚糖層。Simon等[5]1998年研究表明，茁霉多糖在胞外的聚集和細(xì)胞內(nèi)糖原濃度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，但是糖原如何轉(zhuǎn)化茁霉多糖的機(jī)制還沒(méi)有搞清楚。

Catley和McDowell在總結(jié)各自研究結(jié)果和數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，提出下面的茁霉多糖生物合成的途徑[6]。第一步是UDPG（尿苷二磷酸葡糖）把一個(gè)D－葡萄糖基轉(zhuǎn)到脂質(zhì)磷酸（L－P）上形成焦磷酸葡糖（L－P－P－G），然后再轉(zhuǎn)移一個(gè)D－葡萄糖基形成脂質(zhì)鍵合的異麥芽糖（L－PP－G6－G1）和麥芽糖基（L－P－P－G4－G1），接著再?gòu)腢DPG轉(zhuǎn)移一個(gè)D－葡萄糖，或用L－P－P－G上的葡糖基與脂質(zhì)鍵合的異麥芽糖基作用，生成脂質(zhì)鍵合的異潘糖基和潘糖基（中間體，見(jiàn)圖2），最后這些活性的異潘糖基和潘糖基相互聚合，形成茁霉多糖鏈，見(jiàn)圖3。

2 菌種

有關(guān)茁霉多糖生產(chǎn)菌種報(bào)道最多的是出芽短梗霉（A.pullulans），出芽短梗霉（A.pullulans）是一種普遍存在的由環(huán)境分離的真菌。它們生長(zhǎng)于土壤、水和腐生物的腐爛葉、亂拋垃圾等。大部分出芽短梗霉能夠生產(chǎn)茁霉多糖，但不是全部。除出芽短梗霉外，其他有報(bào)道的一些生產(chǎn)茁霉多糖的微生物總結(jié)見(jiàn)表1。

表 1 茁霉多糖主要生產(chǎn)菌株Table 1 Microbial sources of pullulan

茁霉多糖產(chǎn)生菌在腐生菌銀耳腸膜菌Tremellamesenterica[7]，寄生真菌Cytaria harioti和C.darwinii[8-9]和板栗枯萎病真菌、寄生藻類菌Cryphonectria parasitica[10]中（這是第1次報(bào)道寄生藻類菌生產(chǎn)茁霉多糖）也有分離。從子囊菌中分離到的多糖，類似于從出芽短梗霉腸膜菌素中分離到的多糖，其鍵1∶1的比例不同于眾所周知的出芽短梗霉產(chǎn)生的茁霉多糖2∶1[11]。一個(gè)從中國(guó)植物葉片中分離得到的酵母菌—紅酵母，報(bào)道稱茁霉多糖產(chǎn)量高并且未產(chǎn)生黑色素[12]。那淑敏[13]從加拿大切峰蟲繭上分離到菌株A22，其按照Hermanides－Nijhhof分類系統(tǒng)，與出芽短梗霉變種（A.pullulans Am.Var.pullulans）相似。Pollock等[14]從San Diego的一種植物樹(shù)葉表面分離到一種出芽短梗霉菌株，能生產(chǎn)高分子量的茁霉多糖，同時(shí)色素產(chǎn)量大大降低。此外，S.Prasongsuk等[15]還對(duì)泰國(guó)土壤中的出芽短梗霉菌株進(jìn)行研究，希望能獲得低色素高產(chǎn)的茁霉多糖。S V N Vijayendra等[16]對(duì)出芽短梗霉CFR-77菌株進(jìn)行研究，以5%椰子樹(shù)汁制得的粗糖為唯一碳源，發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞始終呈酵母狀并帶有厚垣孢子，菌體不產(chǎn)生色素，發(fā)酵72 h產(chǎn)量達(dá)到51.9 g/L，此菌株發(fā)酵周期短，多糖產(chǎn)量高且黏性好。Hyung-Pil Seo等[17]對(duì)出芽短梗霉ATCC4202進(jìn)行紫外誘變，得到誘變株出芽短梗霉HP－2001，該菌株發(fā)酵時(shí)無(wú)色素產(chǎn)生，所產(chǎn)的高分子量普魯藍(lán)多糖不會(huì)因糖濃度的升高而被分解。

3 培養(yǎng)條件

糖類如蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖、淀粉、低聚糖都可以作為出芽短梗霉的碳源，而木糖、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、乳糖，雖然使用的很少但也可以作為碳源，只是多糖的產(chǎn)量低。而丙三醇在有誘導(dǎo)葡萄糖存在的條件下也可以作為碳源，誘導(dǎo)作用會(huì)被放線菌酮抑制，這表明合成新蛋白質(zhì)是一個(gè)必不可少的步驟。葡萄糖果糖或者能降解成這些糖的糖類都可以用作碳源。

Schuster等[18]以不產(chǎn)黑色素的出芽短梗霉突變株研究不同碳源（蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖和乳糖等）對(duì)茁霉多糖產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)不同的碳源間存在顯著的差異，蔗糖為最佳碳源。Gniewosa等[19]比較了11種5%濃度的碳源對(duì)出芽短梗霉AP3合成茁霉多糖的影響,蔗糖為最佳碳源，發(fā)酵5 d茁霉多糖濃度最高,其次為麥芽糖、木糖、葡萄糖、甘露糖和果糖，以核糖、阿拉伯糖、半乳糖和淀粉為碳源時(shí),茁霉多糖產(chǎn)量較低。Kato等[20]發(fā)現(xiàn)在20%麥芽糖的水解產(chǎn)物中,出芽短梗霉發(fā)酵的茁霉多糖的濃度比在葡萄糖漿中得到的高115%。其它的農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)的廢棄物，如去蛋白乳清、甜菜糖漿、甜甘蔗汁、泥炭水解物、乙醇發(fā)酵廢液葡萄皮漿都是生產(chǎn)茁霉多糖既經(jīng)濟(jì)又高效的底物。

碳源濃度對(duì)多糖生產(chǎn)也有影響，濃度太低會(huì)成為限制因素，濃度太高又會(huì)產(chǎn)生抑制作用。Le Duy[21]以甜菜糖漿為發(fā)酵底物，發(fā)現(xiàn)在糖漿起始濃度為50 g/L～100 g/L的范圍內(nèi)，隨著糖漿濃度增加，茁霉多糖的濃度也逐漸增高，但如果進(jìn)一步增加糖漿濃度，茁霉多糖濃度反而降低。這種下降可能是因?yàn)樵诎l(fā)酵后期，菌絲產(chǎn)生1種內(nèi)生葡糖糖化酶（又叫葡糖糖化酶B），它不僅可以降解淀粉，還可以降解茁霉多糖。

生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和氮源會(huì)影響茁霉多糖的生產(chǎn)，但不會(huì)影響出芽短梗霉的細(xì)胞形態(tài),銨和復(fù)合氮源比用硝酸鹽要好。Lee和Yoo[22]發(fā)現(xiàn)初始pH6.0時(shí)多糖產(chǎn)量最高。另?yè)?jù)報(bào)道，pH4.5時(shí)最適合多糖生產(chǎn)，pH6.5最適合酵母狀細(xì)胞的生長(zhǎng)[23]。茁霉多糖生產(chǎn)的最適溫度是24℃～30℃，不同菌株間有微小差異。Bender[24]報(bào)道稱VB1可以增加多糖的產(chǎn)量。生物素、氯化鐵、氯化錳和氯化鋅也可以增加多糖的產(chǎn)量[25-26]。

出芽短梗霉是需氧發(fā)酵的，通氣量對(duì)多糖產(chǎn)量有重要的影響。在無(wú)氧條件下發(fā)酵,細(xì)胞既不生長(zhǎng)也不分泌多糖,而大量通氣則可以顯著提高多糖的濃度。這種影響在富含氮的介質(zhì)中很明顯,而在缺氮源的介質(zhì)中，大量通氣,會(huì)抑制茁霉多糖的生成[27]。Audet等[28]認(rèn)為在營(yíng)養(yǎng)均衡的介質(zhì)中，雖然提高溶解氧的濃度，產(chǎn)率也隨之增高，但是大量通氣時(shí)應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎，因?yàn)橥膺^(guò)大，分子質(zhì)量會(huì)降低。Dufresne等[29]發(fā)現(xiàn)茁霉多糖產(chǎn)量與氧氣的分壓關(guān)系很復(fù)雜：隨著氧氣分壓的增加，茁霉多糖產(chǎn)量升高，但是增到一定值后會(huì)迅速降低。Dufresne在試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)通過(guò)增大氣體分壓使氧氣利用率增大，可以改進(jìn)出芽短梗霉生產(chǎn)多糖的活性，高的氣流量和大的工作壓有益于細(xì)胞本體的生長(zhǎng)和茁霉多糖的生成。

攪拌速度過(guò)高和過(guò)低都會(huì)降低多糖的產(chǎn)量。Lazaridou[30]發(fā)現(xiàn)在攪拌速度為300 r/min～700 r/min范圍內(nèi)，茁霉多糖的濃度有明顯增高，在700 r/min時(shí)多糖濃度達(dá)到最大值，此后，再增加攪拌速度，多糖濃度反而下降。Simon[31]發(fā)現(xiàn)在攪拌速度450 r/min，通氣量小于175 L/h時(shí)，茁霉多糖的產(chǎn)量最高；而Gibbs和Seviour[32]也發(fā)現(xiàn)攪拌速度過(guò)大如750r/min，茁霉多糖的濃度會(huì)下降。

Miure等以蔗糖為底物研究發(fā)現(xiàn)，如果在發(fā)酵體系中加入淀粉酶抑制劑，可以抑制后期酶對(duì)茁霉多糖的分解，并且得到的茁霉多糖分子量較大。為解決常規(guī)發(fā)酵生產(chǎn)茁霉多糖伴隨的一些問(wèn)題，避免氧限制，形態(tài)轉(zhuǎn)變及形成色素等難題，Schabtai等[33]建立了雙相發(fā)酵工藝，這種發(fā)酵工藝較單底物發(fā)酵時(shí)間短，產(chǎn)量高，可以用酵母狀真菌出芽短梗霉生產(chǎn)無(wú)色素的茁霉多糖。

許多學(xué)者研究了分批發(fā)酵、補(bǔ)料分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵。近年來(lái)許多學(xué)者開(kāi)始研究固定發(fā)酵的方法。Urkut等[34]對(duì)P56菌株用合成的培養(yǎng)基在海藻酸鈣凝膠球中固定化發(fā)酵，結(jié)果表明這種方法適合分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵。

響應(yīng)面分析法（RSM）是一種新的較好的方法。許多學(xué)者用此方法來(lái)優(yōu)化茁霉多糖的生產(chǎn)條件。Goksungur等用響應(yīng)面分析法對(duì)P56菌株游離細(xì)胞在攪拌釜反應(yīng)器中進(jìn)行了試驗(yàn)，考察了糖濃度、攪動(dòng)速度、通氣量3個(gè)因素。Thibault等通過(guò)搖瓶試驗(yàn)調(diào)查了菌株、碳源、氮源、氮濃度、通氣量、初始pH 6個(gè)因素對(duì)茁霉多糖產(chǎn)量的影響，分析主要因素的影響及因素之間的相互作用，并且用經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛢?yōu)化了6個(gè)因素。Urkut等[34]用響應(yīng)面分析法對(duì)固定化分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵進(jìn)行研究，分析初始pH，攪動(dòng)速率、培養(yǎng)時(shí)間3個(gè)參數(shù)，在試驗(yàn)中海藻酸鈣凝膠球固定化菌種在重復(fù)發(fā)酵中用了6輪，沒(méi)有出現(xiàn)活力的明顯損失。

4 結(jié)論與展望

與發(fā)達(dá)國(guó)家相比我國(guó)的茁霉多糖研究非常落后，1976年～1980年是第1個(gè)研究高峰，主要針對(duì)其性質(zhì)和發(fā)酵方法的研究。1984年～1996年是第2個(gè)研究高峰，主要集中在對(duì)其產(chǎn)生機(jī)理和應(yīng)用研究。日本2009年產(chǎn)量已超萬(wàn)t，從20世紀(jì)70年代中期開(kāi)始生產(chǎn)到現(xiàn)在，日本（主要是日本某一個(gè)公司）仍然壟斷國(guó)際市場(chǎng)。我國(guó)國(guó)內(nèi)學(xué)者現(xiàn)在主要在研究菌株的篩選，而培養(yǎng)基的優(yōu)化方面，需要進(jìn)一步深入研究。

另外，我們?cè)诤Y選高產(chǎn)菌株和不產(chǎn)黑色素菌株的同時(shí)，可以開(kāi)拓一下思路，可以利用黑色素，據(jù)報(bào)道天然黑色素不僅可以用于食用色素添加劑，在化妝品、染發(fā)劑的裝飾、防紫外輻射、清除自由基以及生物殺蟲劑的光保護(hù)等方面應(yīng)用也比較廣泛。目前市場(chǎng)上紅色素、黃色素比較多，天然黑色素還較為罕見(jiàn)。許多研究者一直對(duì)出芽短梗霉發(fā)酵過(guò)程中的黑色素作為雜質(zhì)去除，忽視了黑色素可作為一種天然色素加以開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。有學(xué)者還發(fā)現(xiàn)，在用出芽短梗霉生產(chǎn)多糖時(shí)，不僅可以利用工業(yè)廢棄物作為底物，還可以用一些已知結(jié)構(gòu)的葡萄糖類似物如3－甲氧基－葡萄糖，D－葡萄糖胺和N－乙酰－D－葡萄糖胺作為底物，一些菌株可以單一的生成含葡聚糖和甘露聚糖。

總之，這方面的研究具有很大的開(kāi)發(fā)潛力和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，深入研究，充分利用好，使之產(chǎn)業(yè)化，對(duì)于我們這樣一個(gè)有著豐富資源的農(nóng)業(yè)大國(guó)來(lái)說(shuō)有著重要的意義。

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Research Progress of Upstream Processing of Pullulan Abroad

SU An－xiang，F(xiàn)ENG Yin，LIU Jie，WANG Yu－h(huán)ua*
（School of Food Science and Engineering，Jilin Agriculture University，Changchun 130118，Jilin，China）

Pullulan，a neutral water－soluble extracellular polysaccharide，is obtained by fermentation using a fungus，Aureobasidium pullulans.Pullulan was widely used in food industrial，pharmaceutical industrial and other commercial and industrial areas.It was a promising polysaccharide.But mass production is also small，for two main reasons，one is low yield and the other is difficult to remove the polysaccharide pigment.The latest advances on the study of the microbial sources，synthesis mechanism and culture conditions were reviewed.Its industrial applications and current research focus were discussed.

pullulan；microbial sources；synthesis mechanism；culture conditions

吉林省科技廳科技支撐計(jì)劃（20080251）

蘇安祥（1984—），男（漢），在讀碩士研究生，研究方向：食品微生物與功能性食品。

*通信作者：王玉華（1972—），女（漢），副教授，博士，研究方向：食品微生物與功能性食品。

2011-07-01