王茂龍，楊玉玲，魏朝霞，岳 旺，徐萬群

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院1.胸外科、2.感染科，山東 青 島 266003;3.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，山東青島 266021;4.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院急診內(nèi)科，山東 青 島 266003)

嘔吐是機體的保護(hù)性反射，可由多種因素誘發(fā)，腫瘤化療是最常見的原因之一，高致吐性化療藥順鉑是良好的動物模型致吐劑。人類嘔吐化學(xué)感受器觸發(fā)區(qū)(chemoreceptor trigger zone，CTZ)位于延髓背面極后區(qū)(the area postrema，AP)內(nèi)，與迷走神經(jīng)背核鄰近，順鉑刺激后5-HT、P物質(zhì)等經(jīng)血液循環(huán)至AP區(qū)可以刺激CTZ引起嘔吐。大鼠雖無嘔吐反射，但延髓亦具有AP區(qū)，其作用與CTZ相似，使用順鉑后，5-HT、P物質(zhì)等化學(xué)物質(zhì)作用于CTA，可以產(chǎn)生條件味覺厭惡(conditioned taste aversion，CTA)反應(yīng)，使大鼠產(chǎn)生異嗜高嶺土的行為，其異嗜高嶺土的程度可間接反映嘔吐的程度［1］。

生姜作為傳統(tǒng)中藥已有一千多年的歷史，有“止嘔圣藥”之美譽，姜辣素(gingerol)是生姜提取物之一，其主要成分有［2］-、［4］-、［6］-姜酚和姜烯酚［2－3］等，止吐效果已得到廣泛研究。地塞米松有良好的止吐作用，可聯(lián)合5-HT3受體阻滯劑及NK1受體阻滯劑應(yīng)用［4］，但其具體作用機制尚不清楚。

本研究觀察姜辣素抑制順鉑所致的大鼠異嗜高嶺土行為，并觀察大鼠AP區(qū)神經(jīng)元和回腸末端神經(jīng)節(jié)c-fos蛋白的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 姜辣素(寶雞宏遠(yuǎn)生物制藥，批號2005071223)溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的西黃耆膠;順鉑(齊魯制藥，批號903005CE)溶于50℃溫生理鹽水;鹽酸昂丹斯瓊注射液(奧賽康制藥，批號090102);阿瑞吡坦(Chemvon生物制藥，批號CV2910A006095)溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的西黃耆膠;磷酸地塞米松鈉注射液(魯抗制藥，批號090717302);兔抗c-fos試劑盒(北京博奧森生物bs0469R)。

1.2 動物試驗 健康♂成年Wistar大鼠［華中科技大學(xué)實驗動物中心，SCXK(鄂)2004-0007］36只，體質(zhì)量200～250 g，室溫(22±2)℃，單籠飼養(yǎng)，12 h明暗周期(18:00～6:00為暗周期)。隨機分成6組:空白組、模型組、昂丹司瓊+地塞米松組、阿瑞吡坦+地塞米松組、姜辣素組及姜辣素+地塞米松組。順鉑(3 mg·kg－1)腹腔注射(ip)造模，并于順鉑注射前1 h及注射后24 h、48 h各組分別給予以下處理:生理鹽水(10 mg·kg－1，ig)、西黃芪膠(10 ml·kg－1，ig)、昂丹司瓊(4 mg·kg－1，ip)+ 地塞米松(5 mg·kg－1，ip)、阿瑞吡坦(8 mg·kg－1，ig)+ 地塞米松(5 mg·kg－1，ip)、姜辣素(400 mg·kg－1ig)、姜辣素(400 mg·kg－1，ig)+ 地塞米松(5 mg·kg－1，ip);觀察順鉑注射后0～24 h、48 ～72 h各組大鼠攝食量和啃食高嶺土量。72 h后處死大鼠，取AP區(qū)及回腸末端(距回盲瓣約20 cm)組織于4%的甲醛4℃固定。

1.3 免疫組化和圖像分析 將組織石蠟包埋，切片，嚴(yán)格按照抗c-fos免疫組化試劑盒說明操作。常規(guī)漂洗，抗體封閉，加1∶200稀釋的兔c-fos多克隆抗體，漂洗后加生物素化二抗，顯色，復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片。200倍光鏡下隨機選取5個視野并照相，觀察外周回腸及AP區(qū)組織陽性產(chǎn)物的染色情況。黃光源下為淺黃色背景，標(biāo)記陽性顆粒在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，呈棕黃色或棕褐色。用奧林巴斯圖像分析系統(tǒng)計算陽性細(xì)胞灰度值(0代表強陽性，255代表陰性)。

2 結(jié)果

2.1 嗜高嶺土量 分別記錄0～24 h、48～72 h各組大鼠啃食高嶺土量。兩個時間段內(nèi)，模型組啃食高嶺土量明顯高于正常組(P＜0.01)。0～24 h，各治療組啃食高嶺土量低于模型組(P＜0.05)。姜辣素組及姜辣素+地塞米松組啃食高嶺土量與昂丹斯瓊+地塞米松組相比差異無顯著性。48～72 h，阿瑞吡坦+地塞米松組、姜辣素組、姜辣素+地塞米松組與模型組相比均減少(P＜0.05)。姜辣素組、姜辣素+地塞米松組啃食高嶺土量低于阿瑞吡坦+地塞米松組(P＜0.05)，兩個時間段內(nèi)，姜辣素組與姜辣素+地塞米松組啃食高嶺土量差異無顯著性。

2.2 攝食量 分別記錄0～24 h、48～72 h各組大鼠攝食量。兩個時間段內(nèi)，模型組與正常組相比攝食量減少(P＜0.01)。0～24 h，姜辣素組進(jìn)食量高于昂丹司瓊+地塞米松組和模型組(P＜0.05)，姜辣素+地塞米松組進(jìn)食量高于模型組(P＜0.05)，與昂丹司瓊+地塞米松組比較無差異;姜辣素組進(jìn)食量高于姜辣素+地塞米松組(P＜0.05)。48～72 h，姜辣素組攝食量高于模型組和阿瑞吡坦+地塞米松組(P＜0.05)。姜辣素+地塞米松組與模型組比較差異無顯著性。

Tab 1 The kaolin and food ingestion and c-fos immunoexpression of rats in every group

2.3 c-fos表達(dá) c-fos陽性顆粒在回腸末端組織表達(dá)于肌間神經(jīng)節(jié)(Fig 1)，在AP區(qū)表達(dá)于神經(jīng)元(Fig 2)。模型組陽性顆?；叶戎档陀谡＝M(P＜0.01)。與模型組相比，其余4組陽性顆?；叶戎稻黾?P＜0.05)。昂丹司瓊+地塞米松組、姜辣素組灰度值均低于阿瑞吡坦+地塞米松組(P＜0.05)，姜辣素+地塞米松組灰度值與阿瑞吡坦+地塞米松組比較差異無顯著性。姜辣素組灰度值低于姜辣素+地塞米松組(P＜0.05)。

Fig 1 Immunoexpression for c-fos in the ileum of rats in every group(HE×200)

3 討論

化療誘發(fā)的惡心嘔吐反應(yīng)(chemotherapy-induced nausea and vomiting，CINV)按發(fā)生時間不同可分為預(yù)期性、急性和遲發(fā)性三大類［5］。急性惡心嘔吐(acute CINV)發(fā)生于化療開始后24 h內(nèi)，即本實驗的第0～24 h期。研究表明，神經(jīng)遞質(zhì)5-HT及其受體-3在急性CINV期起主要作用［7］，臨床常用選擇性5-HT3受體拮抗劑(昂丹斯瓊等)對急性期CINV有良好治療作用［8］。本實驗選用昂丹斯瓊聯(lián)合地塞米松作為陽性藥物對照，比較了姜辣素及其聯(lián)用地塞米松在急性CINV期的抗嘔吐效果。遲發(fā)性CINV一般發(fā)生于化療后24～48 h后，有時可持續(xù)長達(dá)1周，相當(dāng)于本實驗的48～72 h時期。上世紀(jì)90年代開始發(fā)現(xiàn)神經(jīng)激肽P物質(zhì)及其受體NK1在遲發(fā)CINV中具有重要作用［9］，本實驗選用選擇性NK1受體拮抗劑阿瑞吡坦聯(lián)合地塞米松作為另一陽性藥物對照，比較姜辣素及其聯(lián)用地塞米松在遲發(fā)性CINV期的抗嘔吐效果。

A:The immunoexpression for c-fos in the AP of the blank control group was light;B:The immunoexpression for c-fos was significant in model group;C:The change of immunoexpression for c-fos in Ondansetron+D group was significant compared with blank control group;D:The change of immunoexpression for c-fos in aprepitant+D group was not significant compared with blank control group;E:The changes of immunoexpression for c-fos in gingerol and gingerol+D groups were similar compared with aprepitan+D group and blank control group.

多項動物實驗結(jié)果表明生姜可抑制順鉑所致惡心嘔吐［10－11］，亦有臨床研究證實生姜可有效改善順鉑化療患者的惡心嘔吐情況［12］。生姜抗嘔吐作用主要有效成分為姜辣素，是［6］-、［8］-、［10］-姜酚(gingerol)和［6］-、［8］-、［10］-姜烯酚(shogaol)等的混合物［2－3］，其作用機制最初認(rèn)為是可阻斷 5-HT3受體［13］，后證實其抑制5-HT3受體的功能并非與5-HT3受體競爭性結(jié)合，而是作用于一個調(diào)節(jié)性位點，此位點可調(diào)節(jié)P物質(zhì)受體和膽堿能受體表達(dá)［14］，也有研究證實姜辣素可作用于辣椒素受體(VR1)［15］，因此，姜辣素通過作用于多種受體發(fā)揮抗嘔吐作用。本研究顯示在0～24 h內(nèi)，姜辣素、姜辣素+地塞米松組啃食高嶺土量與昂丹斯瓊+地塞米松組相比差異無顯著性，即無論是否聯(lián)用地塞米松，姜辣素與昂丹斯瓊聯(lián)用地塞米松抗嘔吐效果相當(dāng)，先前實驗亦證明姜辣素可通過下調(diào)5-HT表達(dá)抑制急性期CINV［16］。阿瑞吡坦+地塞米松組啃食高嶺土量多于昂丹斯瓊+姜辣素組，因阿瑞吡坦為選擇性NK1受體拮抗劑，對主要由5-HT引起的急性期CINV作用較弱，故美國臨床腫瘤學(xué)會(ASCO)腫瘤化療抗嘔吐指南中指出，阿瑞吡坦需與5-HT3受體拮抗劑聯(lián)合應(yīng)用以增強其抗嘔吐效果［4］。姜辣素聯(lián)用地塞米松與單用姜辣素相比食高嶺土量差異無顯著性，說明地塞米松對姜辣素治療急性嘔吐無輔助作用。在48～72 h內(nèi)，姜辣素組、姜辣素+地塞米松組與阿瑞吡坦+地塞米松組相比食高嶺土量減少，即姜辣素抗嘔吐效果優(yōu)于阿瑞吡坦+地塞米松，其原因可能是阿瑞吡坦是單一NK1受體拮抗劑，而姜辣素可通過作用于多種介質(zhì)及受體聯(lián)合發(fā)揮抗嘔吐作用［8］。姜辣素組與姜辣素+地塞米松組食高嶺土量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示地塞米松對姜辣素治療遲發(fā)性嘔吐也無輔助作用。

生姜被證實可逆轉(zhuǎn)順鉑引起的胃排空障礙［17］，增加胃動力［18］，促進(jìn)食欲［19］。本研究中姜辣素組大鼠進(jìn)食量較模型組增加，說明姜辣素作為生姜的有效止吐成分，可促進(jìn)大鼠進(jìn)食。也有學(xué)者認(rèn)為生姜對胃動力的促進(jìn)作用是其止吐機制之一［20］。姜辣素+地塞米松組24 h內(nèi)比模型組攝食量增加，但48～72 h期間，該組大鼠攝食量與模型組差異無顯著性，其原因尚不清楚。

c-fos存在于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，中樞神經(jīng)細(xì)胞受刺激后，引起 c-fos、c-jun轉(zhuǎn)錄，翻譯成 fos、jun等磷蛋白，形成同源或異源二聚體激活蛋白-1(AP-1)，調(diào)節(jié)靶基因編碼，進(jìn)而導(dǎo)致CNS形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能長時程的改變［21］。研究發(fā)現(xiàn)，給哺乳動物注射催吐藥物后可引起腦內(nèi) c-fos蛋白表達(dá)增加［22－23］，給予5-HT3受體拮抗劑預(yù)處理可使急性期c-fos表達(dá)減少［24］，說明c-fos表達(dá)可以從組織學(xué)角度反映嘔吐行為的嚴(yán)重程度。本實驗通過測定延遲期c-fos的表達(dá)，進(jìn)一步證實姜辣素在延遲期抑制大鼠異嗜行為的效果。順鉑注射后大鼠AP區(qū)神經(jīng)元及回腸末端肌間神經(jīng)節(jié)c-fos表達(dá)均增加。治療組c-fos表達(dá)較模型組均減少，其中阿瑞吡坦+地塞米松組、姜辣素組、姜辣素+地塞米松組c-fos表達(dá)均少于昂丹斯瓊+地塞米松組，說明阿瑞吡坦及姜辣素抑制延遲性嘔吐的作用強于昂丹斯瓊。姜辣素聯(lián)用地塞米松后c-fos表達(dá)少于單用姜辣素組，此結(jié)果與兩組大鼠食高嶺土量結(jié)果有差異，原因尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，姜辣素是從天然食用品生姜中提取的有效成分，毒副作用小，無須與地塞米松聯(lián)合應(yīng)用，即對類似于人類嘔吐的大鼠異嗜模型急性期及延遲期均有抑制作用，并可以促進(jìn)大鼠攝食，有利于改善營養(yǎng)狀況，是一種具有臨床實用價值的新型止吐藥物。

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