甄永占，章廣玲，趙毓芳，閆 豐，劉學(xué)軍，呂翠平，徐愛軍

（1.河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，河北 唐山063000；2.河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科，河北 唐山063000）

絲裂原活化蛋白激酶在力達(dá)霉素抑制鼠骨髓瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡中的作用

甄永占1，章廣玲1，趙毓芳1，閆 豐2，劉學(xué)軍2，呂翠平1，徐愛軍1

（1.河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，河北 唐山063000；2.河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科，河北 唐山063000）

目的：研究力達(dá)霉素（LDM）對鼠骨髓瘤細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信號傳導(dǎo)通路的影響及MAPKs在LDM抑制鼠骨髓瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡中的作用，為LDM治療人多發(fā)性骨髓瘤的研究提供依據(jù)。方法：選取處于對數(shù)生長期鼠骨髓瘤細(xì)胞株SP2／0，隨機(jī)分為空白對照組、4種不同濃度LDM組，采用Western blotting方法檢測各組細(xì)胞48 h后MAPK家族的三個主要成員c－Jun氨基末端激酶（JNK）、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）和p38 MAPK的表達(dá)水平。選取處于對數(shù)生長期SP2／0，隨機(jī)分為對照組、LDM組、SP600125組（JNK抑制劑）、SB203580組（p38抑制劑）、U0126組（ERK抑制劑）、LDM＋SP600125組、LDM＋SB203580組和LDM＋U0126組，采用MTS法和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測各組細(xì)胞增殖和凋亡情況。結(jié)果：細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，不同濃度LDM組JNK、ERK和p38 MAPK的表達(dá)水平高于空白對照組（P＜0.05）；各抑制劑組細(xì)胞增殖率和細(xì)胞凋亡率與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），即對細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用均不明顯；但LDM＋SP600125組、LDM＋SB203580組LDM對細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用均降低（P＜0.05），而LDM＋U0126組LDM對細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用則增強(qiáng)（P＜0.05）。結(jié)論：LDM能夠通過激活JNK、p38 MAPK抑制鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2／0細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡。

力達(dá)霉素；細(xì)胞凋亡；骨髓瘤；絲裂原活化蛋白激酶

多發(fā)性骨髓瘤是血液系統(tǒng)發(fā)病居第2位的常見惡性腫瘤，對化療存在普遍抵抗性，目前還是一種難以治愈的致死性疾病。標(biāo)準(zhǔn)的化療方案僅能使40%～60%患者獲得暫時緩解，中位生存期一般不超過3年。大劑量化療聯(lián)合造血干細(xì)胞移植可使緩解率明顯提高，但除了極少數(shù)患者以外，大部分均難免復(fù)發(fā)［1－3］，因此尋找新的抗多發(fā)性骨髓瘤藥成為研究熱點。力達(dá)霉素（lidamycin，LDM）是大分子肽類抗腫瘤抗生素，大量研究［4－7］表明：LDM具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。目前國內(nèi)正在進(jìn)行LDM臨床Ⅱ期試驗研究。本實驗研究LDM體內(nèi)外抗鼠骨髓瘤作用，旨在為今后LDM在多發(fā)性骨髓治療中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑 鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2／0由本室傳代保存。用含10%胎牛血清（Hyclone）的高糖DMEM培養(yǎng)液（Gibco公司），于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，2 d傳代1次，取處于對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。LDM由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所甄永蘇院士惠贈；蛋白定量試劑盒（BCATMprotein assay kit，Pierce公司）；寬范圍蛋白預(yù)染 Marker（New England Biolabs公司）；蛋白質(zhì)印跡發(fā)光液和PVDF膜（Millipore公司）；FITC－AnnexinⅤ 凋亡檢測試劑盒（北京寶賽生物技術(shù)有限公司）；Actin抗體sc－1616（Santa Cruz公司）；HRP標(biāo)記的羊抗兔、兔抗羊和羊抗小鼠IgG抗體（北京中杉金橋有限責(zé)任公司）；絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員抗體試劑盒、磷酸化 MAPK家族成員抗體試劑盒（Cell Signaling Technology 公 司）；JNK 抑 制 劑SP600125、p38 MAPK抑制劑SB203580和MEK抑制劑U0126（Merck公司）。

1.2 細(xì)胞增殖活性檢測 采用3－（4，5－二甲基噻唑－2－磺）－5－（3－羧甲基氧苯基）－2－（4－磺苯基）－2氫四唑內(nèi)鹽（MTS）法測定細(xì)胞存活率。原理是MTS在 吩嗪二甲基硫酸酯（phenazinemthosulfate，PMS）存在的情況下可被活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶類還原，轉(zhuǎn)化成液態(tài)可溶的產(chǎn)物，而死細(xì)胞無該功能。MTS水溶物可用酶標(biāo)儀在波長490 nm處檢測吸光度（A490）值，該值可間接反應(yīng)活細(xì)胞的數(shù)量和活性。取對數(shù)生長期細(xì)胞，輕輕吹打分散成細(xì)胞懸液，記數(shù)后以每孔1×104個的密度接種細(xì)胞于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，2 h后分別加入不同藥物處理48 h，每組至少3個平行孔。每孔加入20μL MTS／PMS混合液（按說明書配制：每2 m L MTS溶液中加入100 L PMS，現(xiàn)用現(xiàn)配），37℃繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h，用酶標(biāo)儀（Thermo Labsystems，Multiskan MK3）于490 nm處測定每個孔的A490值。實驗設(shè)無藥對照孔和無細(xì)胞對照孔，各3孔，按下面公式計算細(xì)胞的存活率：細(xì)胞存活率＝（加藥組A490值－空白組A490值）／（對照組A490值－空白組A490值）×100%。實驗重復(fù)3次。為了研究JNK、p38 MAPK和ERK的激活在LDM抑制SP2／0細(xì)胞增殖中的作用，分為空白對照組、LDM組、SP600125、SB203580和U0126組（分別加入JNK抑制劑SP600125、p38抑制劑SB203580和 ERK 抑 制 劑 U0126）、LDM＋SP600125組、LDM＋SB203580組和LDM＋U0126組，分別用相應(yīng)的抑制劑（SP600125、SB203580和U0126）預(yù)處理SP2／0細(xì)胞2 h，再加入LDM（0.5 nmol·L－1）繼續(xù)作 用 48 h，采用MTS法檢測各組細(xì)胞增殖抑制率。

1.3 FITC－Annexin V／碘化丙碇（PI）雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期細(xì)胞3 m L按5×104／孔接種于6孔板，2 h后加入分別用相應(yīng)的抑制劑（SP600125、SB203580和U0126）預(yù)處理SP2／0細(xì)胞作用2 h，再加入LDM（0.5 nmol·L－1）繼續(xù)作用48 h，收集細(xì)胞，并用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌，將待測細(xì)胞數(shù)調(diào)整為（5～10）×108L－1，取1 m L細(xì)胞于4℃、1000 r·min－1離心10 min，棄上清液，PBS洗滌，將細(xì)胞重懸于Binding Buffer 300μL，加入Annexin V／FITC 10μL，輕輕搖勻，室溫反應(yīng)1 h，加入5μL PI輕輕搖勻，室溫反應(yīng)15 min，細(xì)胞經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過濾后，在流式細(xì)胞檢測儀上進(jìn)行檢測。

1.4 蛋白質(zhì)提取及 Western blotting檢測 收集0.1、0.5、1.0、2.0 nmol·L－1LDM作用48 h及未加藥處理的SP2／0細(xì)胞，用預(yù)冷的1×PBS洗3次，加入新鮮配制的細(xì)胞裂解液（50 mmol·L－1Tris－HCl，p H7.5；1%NP－40；150 mmol·L－1NaCl；1 mmol·L－1Na3VO4；1 mmol·L－1NaF，臨用時加入3種蛋白酶抑制劑：1% 抑蛋白酶肽；10 g·L－1亮抑酶肽；1 mmol·L－1苯甲基磺酰氟）100μL，細(xì)胞與裂解液充分混合，冰浴20 min。于4℃、13000 r·min－1離心15 min，收集上清液于新的微量離心管中，采用BCA法測定蛋白表達(dá)水平。取各樣品等量總蛋白30μg加入0.25倍體積的5×上樣緩沖液，煮沸變性5 min后，在10%十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate－polyacrylamide gel electrophoresis，SDS－PAGE）膠上進(jìn)行電泳。然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，1%BSA封閉1 h，一抗4℃孵育過夜后，加相應(yīng)二抗孵育2 h，膜上滴加化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑（Santa Cruz biotechnology SC－2048），按照試劑盒說明進(jìn)行操作，通過凝膠成像系統(tǒng)拍照保存結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。各組細(xì)胞增殖率和凋亡率組間比較采用χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 Western blotting法檢測LDM作用SP2／0細(xì)胞后MAPKs的表達(dá)水平 不同濃度LDM分別作用SP2／0細(xì)胞48 h后，不同濃度LDM組磷酸化的JNK、ERK和p38 MAPK的表達(dá)水平均高于空白對照組（P＜0.05）。見圖1。

2.2 LDM和JNK不同抑制劑作用后細(xì)胞增殖率0.5 nmol·L－1LDM對細(xì)胞的增殖抑制作用明顯，細(xì)胞增殖率低于空白對照組（P＜0.05）；JNK 抑 制 劑 SP600125（14μmol·L－1）、p38 MAPK抑制劑 SB203580（12.5μmol·L－1）和MEK抑制劑U0126（10μmol·L－1）對細(xì)胞的增殖抑制作用均不明顯，細(xì)胞增殖率與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；SP600125和SB203580分別聯(lián)合LDM組細(xì)胞增殖率高于LDM組（P＜0.05），即 SP600125和 SB03580 聯(lián)合LDM后均降低了LDM對SP2／0細(xì)胞增殖抑制作用，與LDM組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而 U0126聯(lián)合LDM組細(xì)胞增殖率低于LDM組（P＜0.05），即U0126聯(lián)合LDM作用后提高了LDM對SP2／0細(xì)胞增殖抑制作用。見表1。

圖1 Western blotting法檢測SP2／0細(xì)胞MAPKs蛋白表達(dá)電泳圖Fig.1 Electrophoregram of expressions of MAPKs protein in SP2／0 cells detected by Western blotting method

2.3 LDM聯(lián)合JNK不同抑制劑作用后細(xì)胞凋亡率 SP600125組細(xì)胞凋亡率為2.6%±0.7%，與空白對照組（2.3%±0.6%）比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），即凋亡誘導(dǎo)作用不明顯；LDM組凋亡率為20.5%±1.3%，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），LDM＋SP600125組細(xì)胞凋亡率為10.3%±0.9% ，與LDM組凋亡率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明SP600125聯(lián)合LDM可降低LDM對SP2／0細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用。見圖2。

2.4 LDM聯(lián)合p38 MAPK抑制劑作用后細(xì)胞凋亡率 空白對照組細(xì)胞凋亡率為3.1%±0.6%，SB203580組細(xì)胞凋亡率為3.6%±0.7%，二者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），即凋亡誘導(dǎo)作用不明顯；LDM組凋亡率為24.1±1.3%，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；LDM＋SB203580組凋亡誘導(dǎo)率為11.3%±0.9%，與LDM組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明SB203580聯(lián)合LDM可降低LDM對SP2／0細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用。見圖3。

表1 LDM和不同抑制劑作用后細(xì)胞增殖率Tab.1 The proliferation rates of SP2／0 cells after treated with LDMand different inhibitors （n＝3，±s，η／%）

表1 LDM和不同抑制劑作用后細(xì)胞增殖率Tab.1 The proliferation rates of SP2／0 cells after treated with LDMand different inhibitors （n＝3，±s，η／%）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs LDMgroup.

Group Proliferation rate Blank control 100.0±0.0 LDM 43.5±2.3＊SP600125 98.9±5.8 SB203580 99.5±6.2 U0126 98.5±6.7 LDM＋SP600125 61.9±5.2＊△LDM＋SB203580 66.0±4.3＊△LDM＋U0126 26.0±2.6＊△

圖2 LDM聯(lián)合SP600125作用后SP2／0細(xì)胞凋亡率Fig.2 Apoptotic rates of SP2／0 cells after treated with LDMand SP600125

圖3 LDM聯(lián)合SB203580作用后SP2／0細(xì)胞凋亡率Fig.3 Apoptotic rates of SP2／0 cells after treated with LDMand SB203580

2.5 LDM聯(lián)合MEK抑制劑作用后細(xì)胞凋亡率空白對照組細(xì)胞凋亡率為4.1%±0.8%，U0126組細(xì)胞凋亡率為4.3%±0.9%，二者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），即凋亡誘導(dǎo)作用不明顯；LDM組凋亡率為20.6%±1.3%，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；LDM＋U0126組凋亡率為39.8%±1.6%，與LDM組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明U0126聯(lián)合LDM可增強(qiáng)LDM對SP2／0細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用。見圖4。

圖4 LDM聯(lián)合U0126作用后SP2／0細(xì)胞凋亡率Fig.4 Apoptotic rates of SP2／0 cells after treated with LDMand U0126

3 討 論

盡管對多發(fā)性骨髓瘤的生物學(xué)研究取得了長足進(jìn)展，并采用了大劑量化療的治療方案，對于絕大多數(shù)患者來說該病仍是一種難以治愈的致死性疾病。

LDM屬于烯二炔類抗生素，可誘導(dǎo)DNA單、雙鏈的斷裂。大量研究［4－7］表明：LDM具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。本研究結(jié)果顯示：LDM濃度依賴性激活 MAPK家族的3個主要成員：JNK、p38 MAPK和ERK1／2，磷酸化的JNK和p38 MAPK表達(dá)增加在LDM抑制SP2／0細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中起主要作用，而磷酸化的ERK表達(dá)增加參與了SP2／0細(xì)胞的生存。

MAPK屬于絲／蘇氨酸蛋白激酶，廣泛存在于哺乳動物細(xì)胞的胞質(zhì)中，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、發(fā)育、分裂、死亡和細(xì)胞間的功能等一系列生命活動［8－9］。研究［10－12］表明：MAPK 家族中的這3個主要成員JNK、p38 MAPK和ERK1／2既有抗增殖、促凋亡作用，又有促增殖、抗凋亡作用，作用類型取決于細(xì)胞的類型、死亡刺激的性質(zhì)、活化的持續(xù)時間和其他信號通路的活性。

本研究結(jié)果顯示：單獨應(yīng)用3種抑制劑對細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用均不明顯，但JNK抑制劑SP600125或p38 MAPK抑制劑SB203580分別聯(lián)合LDM作用后均降低了LDM對SP2／0細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用，提示JNK和p38 MAPK的激活參與了LDM對SP2／0的細(xì)胞生長抑制和凋亡誘導(dǎo)作用，而MEK抑制劑U0126與LDM合用后提高了LDM對SP2／0細(xì)胞生長抑制作用，提示ERK的激活參與了SP2／0細(xì)胞的生存。

MAPK信號傳導(dǎo)通路是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，在哺乳類細(xì)胞中各個MAPK信號通路之間通過復(fù)雜的機(jī)制既可相互區(qū)別，又可相互調(diào)節(jié)，既有自身的獨立性，相互間又有千絲萬縷的聯(lián)系。JNK、p38 MAPK和ERK 3條通路，或是在上游蛋白激酶，或是在下游作用底物處，總是有其通路的交匯。這種復(fù)雜的、多聯(lián)系的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)是確保細(xì)胞反應(yīng)精確性和準(zhǔn)確性的關(guān)鍵，細(xì)胞對外界刺激的反應(yīng)是綜合了各個信號通路之間的激活或（和）抑制效應(yīng)而產(chǎn)生的。本研究顯示：LDM可顯著激活JNK、p38 MAPK、ERK通路，但LDM最終顯示了強(qiáng)大的凋亡誘導(dǎo)作用，表明LDM作用下各信號通路的平衡傾向于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，LDM能夠通過激活JNK、p38 MAPK抑制鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2／0細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡。

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Role of mitogen－activated protein kinases in proliferation inhibition and apoptosis induction of lidamycin on mouse myeloma cells

ZHEN Yong－zhan1，ZHANG Guang－ling1，ZHAO Yu－fang1，YAN Feng2，LIU Xue－jun2，LV Cui－ping1，XU Ai－jun1
（1.Department of Histology and Embryology，College of Basic Medical Sciences，Hebei United University，Tangshan 063000，China；2.Department of Oncology，Affiliated Hospital，Hebei United University，Tangshan 063000，China）

Objective To investigate the effect of lidamycin（LDM）on signal transmission pathway of mitogenactivated protein kinases（MAPKs）in mouse myeloma cells and the role of MAPKs in cell growth and apoptosis induced by LDM，and to provide basis for research on treatment of human multiple myeloma with LDM.Methods The mouse myeloma SP2／0 cells in logarithm growth phase were selected and randomly divided into blank control group and four different concentrations of LDMgroups.The expression levels of c－Jun amino－terminal kinase（JNK），extracellular signal－regulated kinase（ERK）and p38 MAPK were detected 48 h after culture by Western blotting.And then the SP2／0 cells in logarithm growth phase were selected and randomly divided into control group，LDMgroup，SP600125（JNK inhibitor）group，SB203580（p38 inhibitor）group，U0126 group（ERK inhibitor），LDM＋SP600125 group，LDM＋SB203580 group，and LDM＋ U0126 group.MTS assay was used to detect SP2／0 cell proliferation and flow cytometry was used to analyze apoptosis in various groups.Results The expression levels of JNK，ERK and p38 MAPK in SP2／0 cells in different concentrations of LDMgroups were higher than those in blank control group（P＜0.05）48 h after culture；Compared with blank control group，the apoptotic rates and proliferation rates in different inhibitors groups had no significant differences（P＞0.05），in other words，the proliferation inhibition and apoptosis induction in SP600125 group，SB203580 group，and U0126 group were not obvious.The effects of LDMon the growth inhibition and apoptosis of cells were decreased in LDM＋SP600125 group and LDM＋SB203580 group（P＜0.05）and increased in LDM＋ U0126 group（P＜0.05）.Conclusion LDMcan inhibit the proliferation of mouse myeloma SP2／0 cells and induce apoptosis through activation of JNK and p38 MAPK.

lidamycin；apoptosis；myeloma；mitogen－activated protein kinases

R739.42

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1129－06

2012－05－02

河北省自然科學(xué)基金資助課題（H2012401030）

甄永占（1970－），女，河北省唐山市人，副教授，醫(yī)學(xué)博士，主要從事腫瘤分子藥理學(xué)研究。

甄永占（Tel：0315－3725754，E－mail：yongzhanzhen＠126.com）