劉建鳳，崔栗，安利佳

（1.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071002；2.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連 116024；3.河北省植保植檢站防治科，河北石家莊 050011）

轉(zhuǎn)Al N H X1基因大豆后代遺傳穩(wěn)定性及耐鹽性分析

劉建鳳1，2，崔栗3，安利佳2

（1.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071002；2.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連 116024；3.河北省植保植檢站防治科，河北石家莊 050011）

為了獲得耐鹽性有所提高的轉(zhuǎn)Al N H X1基因大豆后代材料，以已獲得的轉(zhuǎn)Al N H X1基因的6個株系中的3個株系后代為研究對象，通過分別對這3個株系轉(zhuǎn)基因大豆各后代進行PCR分子檢測并結(jié)合耐鹽性鑒定，以分析外源基因在轉(zhuǎn)基因大豆中遺傳穩(wěn)定性和耐鹽性.結(jié)果表明：Al N H X1基因在轉(zhuǎn)基因植株的后代中遺傳；選取3個株系中部分陽性植株做耐鹽性檢測，結(jié)果表明：轉(zhuǎn)基因大豆耐鹽性狀均好于野生型大豆.在150 mmol／L NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因大豆葉片中維持了相對較高的K＋／Na＋比值，相對含水量較野生型提高了9%，而滲透勢降低了39%，表明轉(zhuǎn)基因大豆具有較好的吸水和保水能力；在鹽脅迫下，超氧化物歧化酶（SOD）與過氧化物酶（POD）活性較野生型大豆分別提高了45%與69%.綜上，通過耐鹽篩選獲得的轉(zhuǎn)Al N H X1基因大豆具有較強的耐鹽性.

Al N HX1基因；轉(zhuǎn)基因大豆；遺傳穩(wěn)定性；耐鹽指標

目前全世界約有3.8×108hm2土地存在不同程度的鹽堿化，其中我國約有0.3×108hm2［1］.隨著耕地鹽堿化的逐漸加劇，大豆的種植將不得已利用鹽堿化的土地，而大豆是雙子葉作物中對鹽分較敏感的作物［2］.采用基因工程分子技術(shù)培育耐鹽性強的大豆品種，充分利用和開發(fā)大面積的鹽堿化土地，將具有廣闊的應(yīng)用前景.其中，Na＋／H＋逆向運輸?shù)鞍妆妒苋藗冴P(guān)注，是植物耐鹽的關(guān)鍵因子之一［3－4］.本課題組首次從真鹽生作物——獐茅（Aeluropuslittoralis）中克隆得到Na＋／H＋逆向運輸?shù)鞍谆颍ˋl NHX1），GenBank登錄號AY745739［5］，并構(gòu)建到了載體p UC－119中，采用子房滴注轉(zhuǎn)化方法進行了大豆栽培品種鐵豐29的遺傳轉(zhuǎn)化［6］，已在分子水平上檢測到外源Al N H X1基因成功整合到大豆基因組并在轉(zhuǎn)錄水平上表達，本研究以這些轉(zhuǎn)基因材料為實驗材料與研究基礎(chǔ)，進一步選取其轉(zhuǎn)基因后代進行了分子水平的檢測與鹽脅迫實驗.研究轉(zhuǎn)基因后代植株是否由于外源Al N H X1基因的導(dǎo)入而改善了大豆的耐鹽能力，為今后將該耐鹽基因轉(zhuǎn)入其他經(jīng)濟作物，提高植物的抗鹽堿能力，開展抗耐鹽堿基因工程奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料鐵豐29大豆（野生型大豆）由遼寧農(nóng)科院提供，以鐵豐29為受體的轉(zhuǎn)Al N H X1基因大豆株系為：S4來源于鐵豐29－T0－4，S10來源于鐵豐29－T0－10，S24來源于鐵豐29－T0－24.

1.2 方法

1.2.1 PCR檢測

在大豆4葉期，用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因大豆T1和T2代植株葉片的基因組DNA［5］，并以80 ng基因組DNA為模板，進行轉(zhuǎn)基因植株的PCR分析，檢測引物是F1／R1（GCACCTTCCTTGGAGTGTTTGCT／GGTACCGTCAAGTCTTCGTTTTCTCTCA），擴增片段全長476 bp；引物F2／R2（AGAGGGTGAAGGTGATGC／CAAGAAAATCCCCAACCTCCAGTG），擴增片段全長535 bp.PCR反應(yīng)條件為94℃，5 min；94℃，30 s；55℃，45 s；72℃，1 min；30個循環(huán)；72℃，10 min.10 g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物.

1.2.2 轉(zhuǎn)基因大豆后代遺傳性分析

當(dāng)代（T0代）轉(zhuǎn)基因植株自花授粉獲得T1代種子，隨后T1代種子繼續(xù)自交獲得T2代種子，分別對3個株系來源的T1代（208株）與T2代（651株）各植株進行PCR檢測后，對所檢測株系中陽性與陰性植株的比例與遺傳學(xué)上孟德爾分離規(guī)律預(yù)期的理論值進行比較，用卡方檢測研究其是否達到差異顯著性.

1.2.3 植株的鹽脅迫處理

在鹽脅迫處理實驗之前，先將未轉(zhuǎn)化植株在不同鹽處理濃度（50，100，150，200 mmol／L）下培養(yǎng)，篩選到大豆幼苗適宜的預(yù)處理濃度150 mmol／L.隨后將大豆轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株，分別移栽到裝有MS液體培養(yǎng)基塑料缽中，每個處理3缽，每缽培養(yǎng)3株，放置于室溫，晝夜溫度為26～28℃，使其恢復(fù)生長10 d.待苗恢復(fù)生長健壯時，用含150 mmol／L NaCl的鹽水進行澆灌，為避免鹽沖擊造成不良效應(yīng)，采用每天遞增1／4鹽濃度的處理方式，直至預(yù)定的處理濃度（150 mmol／L NaCl）.2周后取樣進行測定各項指標.

1.2.4 滲透勢的測定

3個株系分別取同一部位葉片，在去離子水中浸泡8 h，取出，去離子水沖洗3～5遍后，用濾紙吸凈葉片表面水分，放入液氮中，冷凍后將葉片組織放于醫(yī)用注射器中，室溫下融化，反復(fù)用力擠壓注射器，獲得0.5 m L汁液即可.使用FM－8P型全自動冰點滲透壓計測定滲透勢.

1.2.5 葉片相對含水量測定

3個株系各取3株同一部位葉片，去離子水沖洗干凈，用濾紙吸干葉片表面水分，稱其鮮重，然后在120℃烘箱中殺青30 min，并于80℃鼓風(fēng)干燥箱烘至恒重，最后稱其干重，含水量計算公式

1.2.6 K＋／Na＋比值測定

將轉(zhuǎn)基因大豆植株的葉片和根部組織放置于恒溫干燥箱中，120℃殺青2 h后，80℃烘干至恒重.稱取烘干后樣品0.1 g置于150 m L三角瓶中，加入10 m L體積比為4∶1的濃硝酸與高氯酸混合液，處理過夜后加熱消化，至溶液由棕黃色變?yōu)闊o色，然后冷卻至室溫，分別加入去離子水定溶至100 m L.空白對照為去離子水，重復(fù)3次.使用WFX－120B原子吸收分光光度計測定K＋，Na＋含量，并計算K＋／Na＋比值.

1.2.7 SOD與POD活性

葉片SOD與POD活性測定參照Prochazkova等［7］的方法.

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Origen軟件進行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計數(shù)據(jù)以（平均數(shù)±標準差）表示.組間差異采用單因素方差分析，2組比較采用Student t－test進行分析.P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著.

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)基因植株后代（T1與T2代）遺傳分析

對3個轉(zhuǎn)基因株系后代（T1與T2代）進行遺傳穩(wěn)定性分析.T1代PCR檢測結(jié)果如圖1a和表1所示，在檢測的S4（60株），S10（70株）和S24（78株）轉(zhuǎn)基因株系中，均檢測到大量PCR陽性植株，其陽性率分別為80%，76%和77%，且各株系PCR＋／PCR－比值經(jīng)卡方檢測符合孟德爾分離比（表1）.對T2代轉(zhuǎn)基因株系進行PCR檢測，如圖1b和表2所示，S4（239株），S10（231株）和S24（181株）T2代轉(zhuǎn)基因株系中，也均檢測到PCR陽性植株，其陽性率分別為76%，73%和77%，各株系PCR＋／PCR－比值也均符合孟德爾分離比（表2）.表明該外源基因以單插入位點整合到大豆植株的基因組中，且外源基因可以穩(wěn)定遺傳.

圖1 PCR檢測轉(zhuǎn)化Al NHX1基因大豆材料結(jié)果Fig.1 PCR analysis of the presence of Al NHX1 gene of transgenic plants

表1 T1代轉(zhuǎn)基因（Al NHX1）大豆遺傳分析Tab.1 Segregation of Al NHX1 in T1 generation of transgenic lines

表2 T2代轉(zhuǎn)基因（Al NHX1）大豆遺傳分析Tab.2 Segregation of Al NHX1 in T2 generation of transgenic lines

2.2 鹽脅迫對轉(zhuǎn)基因大豆K＋／Na＋比值的影響

由圖2可以看出，在150 mmol／L NaCl鹽脅迫處理15 d后，野生型大豆植株長勢較弱，且出現(xiàn)部分葉片黃化和死亡的現(xiàn)象，而轉(zhuǎn)基因大豆植株仍然生長正常.同時在非鹽條件下，轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株離子含量差異不明顯，但除了S4株系外其他轉(zhuǎn)基因植株的K＋／Na＋比值普遍略低于野生型對照，這有可能是該外源基因的表達是受鹽脅迫誘導(dǎo)表達的結(jié)果，具體原因還有待進一步分析.而在150 mmol／L NaCl鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因和野生型大豆的葉片和根部K＋／Na＋均有降低，但轉(zhuǎn)基因大豆的K＋／Na＋要明顯高于野生型對照（圖3），表明Al N H X1基因在大豆植株中表達可以提高植物細胞內(nèi)的K＋／Na＋比值，使轉(zhuǎn)基因大豆植株生長正常，表現(xiàn)出其耐鹽性提高.

圖2 鹽脅迫15 d后T2代轉(zhuǎn)基因大豆植株的生長表現(xiàn)Fig.2 Effect of NaCl stress on transgenic soybeans（T2）with salt stress for 15 d

圖3 鹽脅迫下T2代轉(zhuǎn)基因大豆中的K＋／Na＋Fig.3 K＋／Na＋in soybeans（T2 generation）under salt stress

2.3 鹽脅迫對轉(zhuǎn)基因大豆葉片滲透壓與相對含水量的影響

如圖4a所示，轉(zhuǎn)基因大豆的葉片滲透壓測量值高于相應(yīng)鹽濃度處理下的野生型對照大豆的測量值，一般轉(zhuǎn)基因大豆的滲透壓是野生型大豆的1.13～1.55倍.說明轉(zhuǎn)基因大豆能夠相對較好地吸收水分.從圖4b可以看到，轉(zhuǎn)基因大豆與野生型大豆葉片相對含水量之間比較，差異達到了顯著或極顯著水平（P＜0.01，P＜0.05）.轉(zhuǎn)基因大豆的相對含水量是野生型大豆的1.05～1.08倍，進一步表明轉(zhuǎn)基因植株葉片的保水能力明顯高于野生型植株，故其耐鹽能力較強.正常生理條件下二者滲透壓的大小以及相對含水量差別不明顯.

圖4 鹽脅迫下轉(zhuǎn)Al NHX1基因（T2代）與野生型大豆?jié)B透壓與相對含水量的變化Fig.4 Osmotic potential and relative water content（RWC）in leaves of T2 of transgenic soybeans under salt stress

2.4 鹽脅迫對轉(zhuǎn)基因大豆POD／SOD活性的影響

如圖5所示，SOD活性在無鹽脅迫下野生型與轉(zhuǎn)基因植株相差不大，但鹽脅迫后，野生型急劇下降，而轉(zhuǎn)基因植株略有下降，轉(zhuǎn)基因大豆SOD活性為野生型大豆的1.34～1.45倍.結(jié)果表明，在鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)入獐茅Al N HX1基因的大豆膜受到的氧化傷害較小，在一定程度上反映了細胞抗脅迫代謝過程.與無鹽處理的對照相比，鹽脅迫后野生型的POD下降明顯，轉(zhuǎn)基因大豆POD活性為野生型大豆的1.46～1.69倍，轉(zhuǎn)基因植株除S10略升高外，另2個均下降，但下降幅度小，表明在一定程度上外源Al N H X1基因在大豆中的成功表達提高了轉(zhuǎn)基因植株自身清除體內(nèi)超氧離子的能力.

3 討論

液泡膜Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因（NHX）在改良植物耐鹽性方面具有重要作用，且已越來越受到人們的廣泛關(guān)注.前人的研究表明，轉(zhuǎn)化外源Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因能夠明顯地改善植物的耐鹽性［8－12］.但是，研究表明，不同植物來源的基因和轉(zhuǎn)化目的不同的植物，對轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性也有明顯的影響.1999年Apse等［13］首次將擬南芥液泡膜Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因（At N HX1）遺傳轉(zhuǎn)化到擬南芥中并在植株中過量表達，獲得的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在200 mmol／L NaCl鹽脅迫條件下生長不受任何影響，植株生長正常.Zhang和Blumwald［10］在番茄中也成功表達了At N H X1基因，且發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因番茄可以在200 mmol／L NaCl條件下正常生長，同時葉片中Na＋含量高，但番茄果實中含量卻很低.繼而，Ragopal等［11］人在油菜（Brassianapus）中過量表達了At NHX1基因，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因油菜植株體內(nèi)的含鹽量占到了其植株干重的6%左右，但在高鹽（200 mmol／L NaCl）脅迫下對轉(zhuǎn)基因植株的生長僅造成了輕微影響，且作物產(chǎn)量和品質(zhì)均沒有受到鹽漬土壤的影響.將雙子葉鹽生植物濱藜（Atriplexgmelini）的液泡膜Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因Ag N H X1在水稻中高效表達，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻可以在300 mmol／L NaCl處理3 d后仍然存活，而野生型對照植株死亡［8］.在本研究中，通過大豆子房滴注轉(zhuǎn)化法將耐鹽Al N HX1基因成功整合到大豆基因組中并表達，各株系后代植株經(jīng)PCR檢測分析表明，外源Al NHX1基因可以按著孟德爾遺傳方式穩(wěn)定遺傳.轉(zhuǎn)基因大豆耐鹽性生理指標檢測表明在150 mmol／L鹽脅迫處理15 d后，轉(zhuǎn)基因大豆植株的生長狀況明顯好于野生型對照大豆植株，此結(jié)果表明，外源Al N HX1基因是一個非常有效的耐鹽基因，大大改善了轉(zhuǎn)基因大豆植株的耐鹽性，為培育耐鹽性強的大豆品種提供了重要的種質(zhì)資源.

細胞內(nèi)維持較高的K＋／Na＋對于植物進行正常的生命活動具有重要作用.因此，限制Na＋從根部向地上部的轉(zhuǎn)運是植物在高鹽脅迫下維持植物葉片細胞最佳離子狀態(tài)的有效途徑之一［14］.在本研究中，通過對150 mmol／L NaCl鹽脅迫處理2周的轉(zhuǎn)基因大豆植株葉片和根部的K＋／Na＋含量的測定可以看出轉(zhuǎn)基因大豆的葉片內(nèi)K＋／Na＋高于野生型對照大豆植株.在轉(zhuǎn)水稻Os N HX1基因的轉(zhuǎn)基因黑麥草和轉(zhuǎn)擬南芥At－N H X1基因的轉(zhuǎn)基因小麥中，其植株葉片內(nèi)K＋／Na＋比值明顯高于野生型對照植株［12，15］，此結(jié)果與本課題組的實驗結(jié)果基本類似.另外，Saqib等［16］研究指出耐鹽小麥品種表現(xiàn)了較高的液泡膜Na＋／H＋轉(zhuǎn)運蛋白基因表達量，且其植株由根部向地上部運輸?shù)腘a＋含量也明顯高于鹽敏感基因型小麥.由于耐鹽植物獐茅具有發(fā)達的根系，推測獐茅中的液泡膜Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運蛋白可能是通過根部細胞的液泡來進行鹽離子區(qū)隔的，從而使易于受傷害的植株葉片減少Na＋的毒害作用.滲透壓與葉片含水量的多少，在一定程度上反映了植株的生長狀況.在相同鹽濃度處理條件下，轉(zhuǎn)基因大豆的葉片含水量與滲透壓較野生型大豆有明顯提高.且SOD與POD活性也均有明顯提高.這些實驗結(jié)果與Yamaguchi等［17］的研究結(jié)果一致.本實驗結(jié)果進一步表明，通過轉(zhuǎn)單一的Na＋／H＋逆向運輸?shù)鞍谆蚩梢悦黠@提高植物的耐鹽性，也說明了利用基因工程的分子育種手段改善植物的耐鹽性，是有效的耐鹽育種基因工程策略.

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Genetic stability analysis and salt tolerance of the progenies of soybean transformedAl NHX1 gene

LIU Jian－feng1，2，CUI Li3，AN Li－jia2
（1.College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，China；2.School of Life Science and Biotechnology，Dalian University of Technology，Dalian 116024，China；3.Preventive Laboratory，The Plant Protection and Quarantine of Hebei，Shijiazhuang 050011，China）

To obtain the progenies ofAl N H X1－expressing soybean with increasing salt－tolerant capacity，three of six transgenic soybean lines and their progenies which introduced the Na＋／H＋antiporter gene（Al NHX1）were used as materials to perform the genetic stability，analyse their resistance to salt stress.The results showed that theAl N H X1 gene could inherit steadily in transgenic soybean plants.Under 150 mmol／L NaCl salt stresses，a higher ratio of K＋to Na＋was retaining in the leaves of the transgenic plants.The osmotic potential in the leaves of the transgenic plants decreased by 39%and relative water increased by 9%.Transgenic plants also indicated an increase in SOD（45%）and POD（69%）activities over wild－type plants.The results demonstrated that theAl N H X1 gene was strongly expressed in soybean，with the increasing its salt－tolerant capacity under 150 mmol／L NaCl salt stress.

Al N HX1 gene；transgenic soybean plants；genetic stability； salt－tolerance index

S521

A

1000－1565（2012）02－0173－07

2011－09－10

保定市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計劃項目（11ZF096）

劉建鳳（1979－），女，河北衡水人，河北大學(xué)講師，主要從事基因工程方面研究.

安利佳（1955－），男，遼寧丹東人，大連理工大學(xué)教授，主要從事生物工程研究.E－mail：bioeng＠dlut.edu.cn

趙藏賞）