王建剛，錢(qián) 昕，宋 瑩，劉 玲，席守民，崔朝初

目前，消化道腫瘤的治療仍是以手術(shù)為主的綜合性治療，運(yùn)用中藥材治療惡性腫瘤是臨床研究的重要課題。近年來(lái)我國(guó)用中西醫(yī)綜合治療的原則,使癌癥患者生存率顯著提高[1]。壁虎是我國(guó)傳統(tǒng)的治療腫瘤的中藥材，大量臨床和基礎(chǔ)研究表明壁虎確有抗腫瘤作用，特別對(duì)消化道腫瘤作用顯著[2-3]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)壁虎有效成分進(jìn)行分離純化，得到壁虎粗多肽(gecko crude peptides，GCPS)，并研究其對(duì)消化道腫瘤細(xì)胞的體外增殖抑制作用。

1 材料和方法

1.1藥物和儀器壁虎來(lái)源：中藥壁虎購(gòu)自河北保定安國(guó)市光明飲片加工廠有限公司(批號(hào)090301)，經(jīng)鑒定為多疣壁虎(Gecko japonicus)；細(xì)胞株：食管癌細(xì)胞EC109，肝癌細(xì)胞HepG2和胃癌細(xì)胞MGC803均由中國(guó)藥科大學(xué)饋贈(zèng)；儀器與試劑：二氧化碳培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司)，倒置顯微鏡GZX-DH-40×45型(德國(guó)Leica公司)，超凈工作臺(tái)SP2DJ22B型(浙江金壇市榮華儀器制造有限公司)，ELx800酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)，AL104電子天平(瑞士梅特勒托利多公司)，L50膠體磨(上海諾尼公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器公司)，3 500KD透析袋(美國(guó)Amresco公司)，冷凍干燥儀(德國(guó)MartinChrist公司)，96孔、6孔培養(yǎng)板(美國(guó)Costar公司)，實(shí)驗(yàn)用其他試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1 GCPS的提取 干壁虎1 000 g粉碎為粗粉，置于4 000 mL Tris-HCl緩沖液中(pH=7.4)，浸泡過(guò)夜，膠體磨破碎細(xì)胞，離心2次(11 000 r/min，20 min)，取上清，加無(wú)水乙醇至終濃度為55%，放4℃冰箱中，每30 min攪拌1次，4 h后離心1次(11 000 r/min，20 min)，取上清，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇，經(jīng)鹽溶鹽析，透析得到的多肽即GCPS。

1.2.2 MTT法檢測(cè)GCPS的體外抗腫瘤作用 將RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的食管癌細(xì)胞EC109、肝癌細(xì)胞HepG2和胃癌細(xì)胞MGC803分別接每孔1×104/mL接種于96孔板, 用不同濃度 (0.375、0.75、1.0、1.5、3.0 mg/mL) 的GCPS,處理24、48、72 h,結(jié)束前4 h每孔加入新鮮配制5 mg/mL MTT 液20 mL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄去培養(yǎng)基, 每孔加入二甲基亞砜 (DMSO) 150 μL，待完全溶解后, 酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm 波長(zhǎng)處各孔的吸光度A，并按下式計(jì)算抑制率。抑制率(%) = [1-(實(shí)驗(yàn)組A×陰性對(duì)照組A)] ×100%。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞形態(tài)變化實(shí)驗(yàn)中用倒置顯微鏡觀察對(duì)照組細(xì)胞均形態(tài)飽滿(mǎn)、增殖迅速、成簇正常生長(zhǎng)樣貼壁生長(zhǎng)良好, 形態(tài)呈多角形或短梭形, 胞核圓形或橢圓形, 核仁多為2～ 3個(gè), 胞漿透亮；24 h時(shí)，1.5 mg/mLGCPS作用的3種消化道腫瘤細(xì)胞雖仍有大量增殖，但均出現(xiàn)皺縮變圓的形態(tài)；48 h時(shí)，1.0 mg/mL的GCPS作用的3種消化道腫瘤細(xì)胞胞體變小、變圓,貼壁細(xì)胞數(shù)目減少, 胞漿透亮度下降, 顆粒感增強(qiáng),部分細(xì)胞胞突回縮變圓,脫落呈懸浮狀,細(xì)胞膜崩潰,可見(jiàn)細(xì)胞碎片；72 h時(shí)，以上細(xì)胞改變更為明顯。

2.2 GCPS對(duì)食管癌細(xì)胞EC109增殖的影響與對(duì)照組比較, 0.375、0.75、1.0、1.5、3.0 mg/mL GCPS能夠顯著抑制EC109細(xì)胞的生長(zhǎng)(P<0.01或P<0.05) ，抑制作用隨濃度、時(shí)間的增加而不斷加強(qiáng),呈一定劑量和時(shí)間依賴(lài)性。24 h時(shí)3 mg/mL、1.5 mg/mL的GCPS對(duì)EC109細(xì)胞的增殖抑制作用明顯(P<0.01)；作用48、72 h時(shí)所有劑量的GCPS對(duì)EC109細(xì)胞的增殖抑制作用特別明顯(P<0.01)。3.0 mg/mL的GCPS各個(gè)時(shí)段對(duì)EC109細(xì)胞的增殖抑制作用與5-FU藥物組比較差異無(wú)顯著性，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同濃度GCPS對(duì)食管癌細(xì)胞EC109的增殖抑制作用

①與對(duì)照組相比P<0.05，②與對(duì)照組相比P<0.01，③與氟尿嘧啶組相比P<0.05

2.3 GCPS對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2增殖的影響0.75～3.0 mg/mL濃度的GCPS在24、48、72 h能顯著抑制HepG2細(xì)胞的增殖，其抑制效應(yīng)呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性，提示壁虎粗多肽體外能夠抑制HepG2細(xì)胞的增殖，具有抗腫瘤活性。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同濃度GCPS對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖抑制作用

①與對(duì)照組相比P<0.05，②與對(duì)照組相比P<0.01，③與氟尿嘧啶組相比P<0.05

2.4 GCPS對(duì)胃癌細(xì)胞MGC803增殖的影響與對(duì)照組比較,0.75～3.0 mg/mL GCPS能夠顯著抑制MGC803細(xì)胞的生長(zhǎng)(P<0.01或P<0.05)，其抑制作用隨濃度、時(shí)間的增加而不斷加強(qiáng),呈一定劑量和時(shí)間依賴(lài)性。作用24 h時(shí)1.0～3.0 mg/mL的GCPS對(duì)MGC803細(xì)胞的增殖抑制作用明顯(P<0.01)；作用48、72 h時(shí)所有劑量的GCPS對(duì)MGC803細(xì)胞的增殖抑制作用明顯(P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同濃度GCPS對(duì)胃癌細(xì)胞MGC803的增殖抑制作用

①與對(duì)照組相比P<0.05，②與對(duì)照組相比P<0.01，③與氟尿嘧啶組相比P<0.05

2.5 GCPS作用于3種細(xì)胞的比較如圖1A所示，GCPS作用24 h時(shí)，對(duì)食管癌細(xì)胞EC109、肝癌細(xì)胞HepG2和胃癌細(xì)胞MGC803都具有增殖抑制作用，IC50分別為2.0 mg/mL、2.3 mg/mL和2.8 mg/mL；如圖1B所示，GCPS作用72 h時(shí)，3種細(xì)胞的IC50分別為1.1、1.2、1.4 mg/mL；如圖1C所示，GCPS作用72 h時(shí)，3種細(xì)胞的IC50分別為0.4、0.6、0.8 mg/mL，由線(xiàn)性圖分析可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)GCPS對(duì)3種消化道腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用增強(qiáng)。

圖1 GCPS對(duì)3種消化道腫瘤細(xì)胞作用比較

3 討論

臨床經(jīng)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，壁虎具有肯定的抗腫瘤作用，并且在實(shí)體瘤治療方面有良好的應(yīng)用前景[1-3]。目前各相關(guān)研究均對(duì)壁虎提取物成分做了初步分析，提出了可能的有效成分。然而迄今為止，壁虎提取物抗腫瘤有效成分仍未明了。壁虎多糖體外抗腫瘤作用明顯，但實(shí)驗(yàn)證明體內(nèi)作用不明顯[4]；楊麗華、楊金霞等提出是大分子蛋白在發(fā)揮作用，但李耀輝等根據(jù)研究結(jié)果認(rèn)為并非如此[5]；李欽青等研究了壁虎小分子肽的抗腫瘤作用，但其小分子肽的來(lái)源主要是人為酶解的產(chǎn)物[6]。我們課題組已經(jīng)進(jìn)行了一些前期研究，采用血清藥理學(xué)的研究方法，發(fā)現(xiàn)干壁虎粉末可以抑制食道腫瘤細(xì)胞(EC9706,EC109)的生長(zhǎng)增殖，并能顯著抑制小鼠S180肉瘤的增殖[7]。進(jìn)一步驗(yàn)證和解釋了壁虎對(duì)消化道腫瘤的特殊療效。用壁虎醇提物對(duì)食道癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞也進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)壁虎醇提物也有明顯的抗腫瘤作用[8-10]。

經(jīng)初步分析壁虎醇提物仍然含有多糖類(lèi)、蛋白質(zhì)(或多肽和氨基酸)、脂肪類(lèi)和其他極性較強(qiáng)的物質(zhì)。大分子蛋白質(zhì)由于在乙醇的作用下大多沉淀，在醇提物中的分子量不很大，而含有較多的多肽和氨基酸。多肽分子具有廣泛生物活性, 同時(shí)具有分子量小、制備容易、純度高、抗原性弱、功能較明確、特異性強(qiáng)、毒副作用小、易于多途徑吸收等大分子蛋白不可比擬的優(yōu)點(diǎn)[11]。本實(shí)驗(yàn)中我們用低濃度硫酸銨首先對(duì)壁虎醇提物中多肽進(jìn)行溶解，繼而用高濃度硫酸銨使多肽析出，再用半透膜透析使硫酸銨鹽和其他小分子物質(zhì)除掉，從而得到多肽類(lèi)物質(zhì)即GCPS。用硫酸銨鹽溶鹽析在一定條件下不會(huì)使蛋白質(zhì)變性，為此GCPS保持了抗癌活性。實(shí)驗(yàn)中，以3種常見(jiàn)的消化道腫瘤細(xì)胞即人食管癌細(xì)胞EC109、人肝癌細(xì)胞HepG2和人胃癌細(xì)胞MGC803為模型，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化、用MTT法比較藥物的抑瘤率，從而了解GCPS對(duì)消化道腫瘤細(xì)胞的作用。結(jié)果顯示GCPS具有明顯的抗以上3種消化道腫瘤作用，且呈量效關(guān)系和時(shí)間依賴(lài)性。比較GCPS對(duì)食管癌細(xì)胞EC109、肝癌細(xì)胞HepG2、胃癌細(xì)胞MGC803的作用，其作用48 h的IC50分別為1.1、1.2、1.4 mg/mL，作用72 h的IC50分別為0.4、 0.6、 0.8 mg/mL，由此看出GCPS對(duì)食管癌細(xì)胞EC109的作用較肝癌細(xì)胞HepG2和胃癌細(xì)胞MGC803的增殖抑制作用明顯，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異無(wú)顯著性。

本研究證明了GCPS對(duì)3種消化道腫瘤細(xì)胞在體外有明顯作用。這3種消化道腫瘤細(xì)胞在腫瘤發(fā)生中占有重要地位。食管癌是世界一些國(guó)家和地區(qū)常見(jiàn)的惡性腫瘤。中國(guó)是世界上食管癌的高發(fā)國(guó)家，也是世界上食管癌高死亡率的國(guó)家之一，年平均死亡率為1.3～90.9/10萬(wàn)，而世界人口標(biāo)化死亡率為2.7～110.6/10萬(wàn)。肝癌是臨床上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，根據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，全世界每年新發(fā)肝癌患者約60萬(wàn)，居惡性腫瘤的第5位。目前我國(guó)發(fā)病人數(shù)約占全球的半數(shù)以上，占全球肝癌病人的55%，已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅我國(guó)人民健康和生命的一大殺手。胃癌也是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在我國(guó)其發(fā)病率居各類(lèi)腫瘤的首位[12]。這些腫瘤目前藥物治療效果不佳，研究開(kāi)發(fā)治療這些常見(jiàn)惡性腫瘤的藥物很有必要，因此對(duì)GCPS研究具有重要的意義?？鼓[瘤多肽主要通過(guò)下列機(jī)制發(fā)揮作用[13]:①提高自身免疫水平，激活細(xì)胞免疫、體液免疫; 通過(guò)人工模擬抗原結(jié)合肽，刺激免疫活性細(xì)胞，促進(jìn)其分化成熟，提高免疫細(xì)胞的活性和數(shù)量，從而增強(qiáng)自身抗腫瘤的能力。②直接殺傷腫瘤細(xì)胞，或阻斷腫瘤細(xì)胞特殊的信號(hào)途徑誘導(dǎo)其凋亡。③抑制腫瘤新生血管的生成。GCPS如何發(fā)揮其抗腫瘤作用，有待進(jìn)一步研究。

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