季 敏，余長(zhǎng)林，余選富，劉定江，劉學(xué)洪，史憲偉＊

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明650201；2.云南省騰沖縣畜牧工作站，云南 騰沖679100）

STAT（Signal transducer and activator of transcription，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子）是一族蛋白質(zhì)，包括STAT1，2，3，4，5A，5B，6共7個(gè)成員，它們主要介導(dǎo)若干激素和細(xì)胞因子的活動(dòng)［1］。STAT5A基因位于牛的19號(hào)染色體上［2］，作為乳腺調(diào)控因子主要調(diào)控靶基因中催乳素和生長(zhǎng)激素的活動(dòng)［3，4］，Ball與Lee的研究已經(jīng)證明乳蛋白基因的表達(dá)受催乳素與腎上腺皮質(zhì)激素的協(xié)同調(diào)控［5，6］，Bauman等證明注射生長(zhǎng)激素對(duì)奶牛的產(chǎn)奶量有提高作用［7］。因此，STAT5A基因可以作為一個(gè)與泌乳有關(guān)的候選數(shù)量性狀位點(diǎn)。國(guó)外對(duì)牛STAT5A基因的研究報(bào)道較多，而在水牛上還未見報(bào)道。Flisikowski等對(duì)不同牛種進(jìn)行了STAT5A基因外顯子7單核苷酸多態(tài)性的研究，結(jié)果在STAT5A基因外顯子7檢測(cè)到1個(gè)SSCP位點(diǎn)，6種基因型［8］。Selvaggi運(yùn)用PCR－RFLP（AvaI酶切）技術(shù)在意大利布朗牛STAT5A基因外顯子7第6853位置發(fā)現(xiàn)了一個(gè)C／T堿基替換，且CC和CT基因型與產(chǎn)奶量，乳蛋白含量和乳脂含量有非常明顯的相關(guān)性。CC基因型比CT基因型產(chǎn)奶量高，CC基因型乳蛋白質(zhì)含量也高于CT基因型，但乳脂含量沒有明顯的差異［9］。Brym在荷斯坦和新澤西州牛的STAT5A基因內(nèi)含子9第9501位置處發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的SNP（A／G）。對(duì)荷斯坦牛來說，不同的基因型與泌乳性狀之間沒有明顯的相關(guān)性，但在新澤西牛中，不同基因型與頭胎次和二胎次泌乳量，乳蛋白率和乳脂率之間存在著明顯的相關(guān)性，GG型牛有高產(chǎn)奶量，而AA和AG型牛蛋白質(zhì)產(chǎn)量高［10］。鮑斌等在中國(guó)荷斯坦牛STAT5A基因內(nèi)含子9第9501位置也發(fā)現(xiàn)了A／G突變［11］。

檳榔江水牛是迄今為止在我國(guó)發(fā)現(xiàn)的惟一的河流型水牛，主要分布在云南省騰沖縣檳榔江流域，已有500余年的飼養(yǎng)歷史［12］。2008年7月11日通過了國(guó)家畜禽遺傳資源委員會(huì)鑒定，其乳用性能較好，是發(fā)展中國(guó)水牛乳業(yè)和云南特色畜牧業(yè)的寶貴種質(zhì)資源［13］。所以對(duì)檳榔江水牛的研究有著重要的意義。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以PCR為基礎(chǔ)的PCR－RFLP和以DNA測(cè)序?yàn)楹诵牡姆肿訕?biāo)記技術(shù)對(duì)特定基因的多態(tài)性研究已經(jīng)很成熟，本文利用PCR－RFLP和測(cè)序技術(shù)研究了STAT5A基因多態(tài)性，為今后探討STAT5A基因?qū)壚平Ｃ谌樾誀畹挠绊懸约傲挤N水牛的保種選育提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

66頭檳榔江水牛來自云南省騰沖縣巴福樂檳榔江水牛良種繁育公司。采其耳朵組織，浸泡于無水酒精中于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用傳統(tǒng)的苯酚／氯仿抽提法。TE溶解，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物合成 根據(jù)NCBI上提供的牛（Bos taurus）的STAT5A基因序列（Gene bank登錄號(hào)：NW＿003104496.1），利用primer3在線設(shè)計(jì)3對(duì)引物P1，P2，P3，引物由上海生工生物工程公司合成。引物序列、PCR產(chǎn)物大小見表1，引物擴(kuò)增區(qū)域詳見圖1。

表1 引物P1，P2，P3的DNA序列，擴(kuò)增區(qū)域和擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度

圖1 STAT5A基因結(jié)構(gòu)和引物位置分布圖

1.2.3 PCR體系與條件 PCR反應(yīng)體系為50 μL：10×Buffer 5μL（含 Mg2＋），上、下游引物（10 μmmol／L）各1.5μL ，dNTPs（2.0mmol／L）1μL，Taq DNA聚合酶0.4μL，DNA 4μL （約50ng），dH2O補(bǔ)至50μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性2min→10個(gè)循環(huán)（94℃變性45s→65℃，退火45s，每個(gè)循環(huán)遞減1℃→72℃延伸2min）→30個(gè)循環(huán)（94℃變性45s→56℃，退火45s，72℃延伸2min）→72℃后延伸8min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠（溴化乙啶染色），電泳檢測(cè)。

1.2.4 測(cè)序 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海立菲生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序采用ABI3730xl測(cè)序儀及配套的BigDye Terminator試劑盒。

1.2.5 PCR－RFLP 酶切反應(yīng)體系為20μL：10×酶解緩沖液2μL，MspI（20I／μL）0.5μL，4μL PCR產(chǎn)物，加水至20μL，37℃水浴4h以上。用1.0%的瓊脂糖凝膠（溴化乙啶染色）電泳檢測(cè)。

1.2.6 序列分析及數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用DNAstar軟件包對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析。等位基因頻率、基因型頻率及Hardy－Weinberg遺傳平衡分析采用excel及SPSS 16.0進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 檳榔江水牛STAT5A基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶清晰，產(chǎn)物片段大小與預(yù)期片段大小相符，特異性良好，可用于測(cè)序和酶切反應(yīng)。電泳檢測(cè)結(jié)果見圖2和圖3。

2.2 測(cè)序結(jié)果及SNP分析

為了檢測(cè)檳榔江水牛STAT5A基因多態(tài)性，我們選擇了8個(gè)水牛個(gè)體進(jìn)行正反雙向測(cè)序。通過對(duì)所有測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)38個(gè)變異位點(diǎn)。其中引物P1擴(kuò)增產(chǎn)物片段發(fā)現(xiàn)24個(gè)變異位點(diǎn)，引物P2擴(kuò)增片段發(fā)現(xiàn)11個(gè)變異位點(diǎn)，引物P3擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)3個(gè)變異位點(diǎn)。所檢測(cè)到的所有變異位點(diǎn)均為單核苷酸變異（SNP），未發(fā)現(xiàn)堿基插入或缺失。其中外顯子8產(chǎn)生2處C924T，C975T突變，氨基酸分析表明，沒有導(dǎo)致308位氨基酸（脯氨酸）和325位氨基酸（絲氨酸）的變化；外顯子13產(chǎn)生2處G1482A，C1548T突變，沒有導(dǎo)致494位氨基酸（脯氨酸）和516位氨基酸（丙氨酸）的變化。檢測(cè)到的 所有SNP位點(diǎn)信息見表2。

圖2 引物P1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖3 引物P2，P3PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

表2 檳榔江水牛STAT5A基因SNP位點(diǎn)

2.3 PCR－RFLP結(jié)果

通過對(duì)引物P3擴(kuò)增片段測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在內(nèi)含子15中一個(gè)C→T堿基替換產(chǎn)生了一個(gè)MspI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，因此我們建立了MspI酶切位點(diǎn)的PCR－RFLP分子標(biāo)記技術(shù)。該變異位點(diǎn)序列見圖4。用MspI限制性內(nèi)切酶對(duì)全部66個(gè)樣品進(jìn)行酶切反應(yīng)，得到的結(jié)果見圖5與表3。

圖4 檳榔江水牛STAT5A基因內(nèi)含子15的一個(gè)變異位點(diǎn)序列

圖5 引物P3擴(kuò)增產(chǎn)物MspI酶切結(jié)果

表3 引物P3擴(kuò)增產(chǎn)物PCR－RFLP檢測(cè)到的基因型頻率和等位基因頻率

檳榔江水牛MspI酶切位點(diǎn)由C和G兩個(gè)等位基因控制，酶切得到三種基因型，分別為CC，CG，GG。基因型為CC的片段被切成452bp和330bp兩條帶；雜合子CG為782bp，452bp和330bp三條帶；基因型為GG的片段只有一條782bp的條帶，未被切開。通過計(jì)算發(fā)現(xiàn)，CG為優(yōu)勢(shì)基因型，C為優(yōu)勢(shì)基因，等位基因C的頻率明顯高于等位基因G的頻率。經(jīng)χ2適合性檢驗(yàn)，檳榔江水牛MspI酶切位點(diǎn)的χ2值為0.546，差異水平不顯著（P＞0.05），說明檳榔江水牛在MspI酶切位點(diǎn)上處于Hardy－Weinberg平衡。

2.4 基因頻率

對(duì)全部66個(gè)樣品用引物P1進(jìn)行擴(kuò)增并全部測(cè)序。通過對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)24個(gè)變異位點(diǎn)。各變異位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率見表4。

表4 引物P1擴(kuò)增產(chǎn)物變異位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率

經(jīng)χ2適合性檢驗(yàn)可得，全部24個(gè)變異位點(diǎn)中有21個(gè)位點(diǎn)差異不顯著，達(dá)到了Hardy－Weinberg平衡，有3個(gè)位點(diǎn)差異顯著，偏離Hardy－Weinberg平衡。

3 討論

在奶牛輔助標(biāo)記選擇中提出了很多基因作為潛在的候選基因，STAT5A因?yàn)樵诖呷樗睾蜕L(zhǎng)激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用而成為候選基因之一。在STAT5A基因中發(fā)現(xiàn)的核苷酸多態(tài)性尤其是單核苷酸多態(tài)性與奶牛的泌乳性狀如產(chǎn)奶量，乳蛋白率和乳脂率有關(guān)聯(lián)。在牛STAT5A基因中已檢測(cè)到許多核苷酸多態(tài)性。Khatib等人在奶牛STAT5A基因外顯子8中發(fā)現(xiàn)一個(gè)SNP位點(diǎn)是G／C堿基替換［14］；McCracken 等人［15］在STAT5A基因內(nèi)含子12中發(fā)現(xiàn)了不同長(zhǎng)度的TG重復(fù)；Flisikowski等人在牛內(nèi)含子15中發(fā)現(xiàn)CCT缺失，而在外顯子16中發(fā)現(xiàn)一個(gè)T／C突變，該突變導(dǎo)致686位的氨基酸由纈氨酸變?yōu)楸彼幔?6，17］；Flisikowski等人還在STAT5A基因的啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNP位點(diǎn)，分別是－247A／G替換 和－226G／A替換，經(jīng)PCR－RFLP分析，這兩個(gè)變異位點(diǎn)存在SgrAI或者Sma I酶切位點(diǎn)［18］。

本研究在檳榔江水牛STAT5A基因中共發(fā)現(xiàn)38個(gè)SNP變異位點(diǎn)，沒有發(fā)現(xiàn)堿基插入或缺失變異。其中內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)34個(gè)變異位點(diǎn)，外顯子中有4個(gè)。騰沖縣位于云南省保山市西南部，西部與緬甸毗鄰，歷史上曾是古西南絲綢之路的要沖，騰沖縣的地理位置決定了檳榔江水牛與亞洲其他水牛種群之間的交流十分頻繁，特別是與國(guó)內(nèi)外沼澤型水牛雜交繁殖，導(dǎo)致檳榔江水牛的遺傳變異十分豐富。其中外顯子8中的兩個(gè)SNP位點(diǎn)都是C／T堿基替換，外顯子13中有2個(gè)SNP位點(diǎn)，分別是G／A變異和C／T變異。外顯子中的4個(gè)變異都是同義突變，沒有引起氨基酸的變化。檳榔江水牛內(nèi)含子15的1個(gè)C／T堿基的替換產(chǎn)生了一個(gè)MspI酶切位點(diǎn)，經(jīng)χ2檢驗(yàn)該酶切位點(diǎn)達(dá)到了Hardy－Weinberg平衡，這說明在此位點(diǎn)的基因型頻率和基因頻率將穩(wěn)定遺傳，處于遺傳平衡狀態(tài)。酶切結(jié)果顯示，該酶切位點(diǎn)CG基因型頻率（0.485）高于CC和GG基因型頻率（0.424，0.091），說明在此位點(diǎn)雜合子是優(yōu)勢(shì)基因型。在特定的條件下雜合子個(gè)體可能比正常純合子個(gè)體更有利于生存和繁殖后代。因此在大規(guī)模群體檢測(cè)中此位點(diǎn)可以作為一個(gè)快速簡(jiǎn)便的遺傳標(biāo)記。對(duì)引物P1擴(kuò)增區(qū)域進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析表明，全部24個(gè)變異位點(diǎn)中有21個(gè)處于Hardy－Weinberg平衡狀態(tài)，只有3個(gè)位點(diǎn)偏離Hardy－Weinberg平衡狀態(tài)（P＜0.05）。偏離 Hardy－Weinberg平衡狀態(tài)的SNP是由于樣本數(shù)量有限還是與選種選育引起的遺傳漂變有關(guān)有待于進(jìn)一步研究。

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