盧劍清，盧 嵩

（北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081）

微透析技術(shù)是利用可溶性小分子可以自由穿透半透膜，而大分子物質(zhì)被截留的特點(diǎn)，以一根微小的探針置于需要檢測(cè)的組織部位，以一定速率向探針內(nèi)灌注與組織內(nèi)體液相似的等滲溶液，在探針頂端的半透膜處與體內(nèi)小分子物質(zhì)透過(guò)濃度梯度進(jìn)行物質(zhì)交換，從而使其進(jìn)入透析液。這樣通過(guò)收集透析液的方法并進(jìn)行檢測(cè)就可以實(shí)時(shí)反映生物體內(nèi)小分子物質(zhì)的情況[1,2]。

本文將微透析探針植入大鼠腦部黑質(zhì)區(qū)，在透析液中加入一定濃度的多巴胺（Dopamine，DA）進(jìn)行灌注，通過(guò)測(cè)定透析后透析液中的DA濃度，對(duì)研究微透析探針的透析效率進(jìn)行了研究[3]。

1 材料

1.1 微透析實(shí)驗(yàn)

Wistar大鼠（200~300g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司）；MAB6.14.1型微透析探針（瑞典MAB公司）；CMA402型微量注射泵、CMA/120 清醒動(dòng)物活動(dòng)裝置、Univentor 820 微量低溫分步收集器（瑞典CMA公司）；SN-1N型腦立體定位儀（日本Narshige公司）；牙科鉆（韓國(guó)STRONG公司）；戊巴比妥鈉（美國(guó)Amresco公司）；多巴胺（美國(guó)Sigma公司）自凝造牙粉（德國(guó)賀利氏公司）；NaCl、KCl、CaCl2、H2O2（分析純，北京化工廠）；手術(shù)刀、止血鉗、手術(shù)剪刀、手術(shù)鑷子等（上海醫(yī)療器械廠）。

1.2 色譜分析

582型二元泵、542型自動(dòng)進(jìn)樣器、5600A型庫(kù)倫陣列檢測(cè)器、6210型電極（美國(guó)ESA公司）；甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)Thermo Fisher公司）；Discovery?HS F5柱(250 mm × 4.6 mm i.d., 5 μm，美國(guó)Supelco公司)、檸檬酸、Na2EDTA（美國(guó)Amresco公司）、Na2HPO4（分析純，北京化工廠）

2 方法

2.1 微透析實(shí)驗(yàn)

2.1.1 微透析探針的植入

取250g左右的大鼠，稱重后以70mg/kg的劑量腹腔注射戊巴比妥鈉，待其昏迷后將其固定在腦立體定位儀上，剃去頭部毛發(fā)，使用手術(shù)刀沿顱骨中鋒劃開頭皮，用止血鉗將頭皮撐開。用3%的過(guò)氧化氫溶液灼燒顱骨上的骨膜，直至清晰露出前囟位置。

以前囟處為原點(diǎn)，在顱骨上找到黑質(zhì)致密部對(duì)應(yīng)的點(diǎn)（前囪后5.2±0.1mm，矢狀縫左側(cè)2.5±0.1mm，顱骨表面下8.5±0.1mm）[4]，用腦鉆鉆穿顱骨，將微透析探針導(dǎo)管置于黑質(zhì)致密部，向下深入7.5±0.1mm（減去探針的透析膜長(zhǎng)度，本實(shí)驗(yàn)中為1mm）。在顱骨的其他部位再鉆兩個(gè)孔，旋入兩個(gè)小螺絲，使用自凝造牙粉將探針導(dǎo)管與螺絲一起固定住。

2.1.2 微透析操作

待大鼠創(chuàng)口恢復(fù)后，使用乙醚輕微麻醉，將微透析探針小心地插入探針導(dǎo)管中，然后將其置于清醒動(dòng)物活動(dòng)系統(tǒng)中。待其清醒后即可進(jìn)行微透析實(shí)驗(yàn)。

透析過(guò)程：0~2h，使用林格氏液（147 mM NaC1，2.3 mM CaCl2，4mM KC1， pH 6.0），2~5h，使用含有DA的林格氏液。

透析液DA濃度梯度：10μM、100μM、1000μM。此時(shí)流速為2μL/min。

透析速度梯度：0.5μL/min、1μL/min、2μL/min。此時(shí)DA濃度為1000μM。

2.2 HPLC-ECD檢測(cè)透析液

使用Discovery?HS F5柱，流動(dòng)相為0.1M檸檬酸、0.2M Na2HPO4、0.3mM Na2EDTA，6%乙腈，pH 3.75，流速為0.8mL/min，進(jìn)樣量40μL。檢測(cè)器電勢(shì)-50、300、350、450mV （主通道350mV）。

2.3 透析效率的計(jì)算

3 結(jié)果

3.1 不同DA濃度對(duì)透析效率的影響

結(jié)果如圖1所示，透析液中DA濃度越大，透析效率越低。但是從總的透析量上來(lái)看，濃度越大能透過(guò)的DA量越大。

3.2 不同透析速度對(duì)透析效率的影響

結(jié)果如圖2所示，透析速度越低，透析效率越高。這是因?yàn)橥肝鏊俣冉档椭螅肝鲆涸谖⑼肝鎏结樀陌胪改ぬ幫Ａ舻臅r(shí)間更長(zhǎng)，從而更加有利于物質(zhì)的交換，使DA能夠透過(guò)更多[5]。

圖1 不同多巴胺濃度對(duì)透析效率的影響

圖2 不同透析速度對(duì)透析效率的影響

4 結(jié)論

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，可以看出，微透析過(guò)程中的透析效率與透析液中的物質(zhì)濃度和透析速度有關(guān)，濃度越小，速度越低，透析效率越高。但是物質(zhì)濃度降低之后，能夠透過(guò)的物質(zhì)總量也隨之減少，透析速度降低之后能夠，要灌注一定量的透析液所需的總時(shí)間也隨之增加，所以要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求選擇合適的物質(zhì)濃度與透析速度。

[1]韓慧婉, 舒鴻鈞, 劉國(guó)詮. 微透析技術(shù)及其應(yīng)用[J]. 化學(xué)通報(bào), 2000, 12:52-56

[2]馮飛, 許崇濤. 微透析技術(shù)在腦組織研究中的應(yīng)用[J]. 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2008, 21(1):55-57

[3]Giuseppe C, Marina M C, Addolorata S C. Simultaneous measurement of adenosine, dopamine, acetylcholine and 5-hydroxytryptamine in cerebral mice microdialysis samples by LC-ESI-MS/MS[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2012,71:183-186

[4]諸葛啟釧譯. 大鼠腦立體定位圖譜(第3版)[M], 北京:人民衛(wèi)生出版社,2007.

[5]關(guān)里, 趙金垣. 微透析技術(shù)在生命科學(xué)中的應(yīng)用[J]. 環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué), 2008, 25(1):94-96