劉星綱 梅 芳 呂培軍 王新知

頜骨缺損的修復一直是口腔臨床上的難題之一。修復方法很多，自體骨和異體骨均存在自身難以克服的缺點。利用支架材料與種子細胞復合構建的人工骨被認為是當今骨缺損治療研究中的一個熱點。 但是以往支架材料的構建較多的使用強度大而降解性能差的材料[1]。近年來有學者嘗試使用降解性能更佳的β 磷酸三鈣修復骨缺損取得了良好的成骨效果[2]。我們與浙江大學合作研發(fā)具有自主知識產權的納米β-磷酸三鈣/膠原(Nβ-TCP/Co)在前期研究中證明降解性能雙向可調，具有良好的微觀結構與宏觀可塑性，生物相容性較好[3]。本實驗考慮采用NβTCP/Co作為載體，與兔自體骨髓間充質干細胞(bonemesenchymal stem cells,BMSCs)復合成人工骨，初步探討其修復骨缺損的效果，為骨組織工程支架材料的進一步研究和臨床應用提供理論基礎和實驗依據。

1.材料與方法

1.1實驗動物與材料 3－4月齡新西蘭大白兔兩只，北大醫(yī)學部動物部提供并負責日常飼養(yǎng)。醫(yī)藥級甘氨酸由上海生工生物工程技術服務有限公司提供?；谇捌谠囼灲Y果，配成10g/L甘氨酸液，過濾除菌后備用[4]。NβTCP/Co是與浙江大學合作研發(fā)，主要成分是納米級β 相磷酸三鈣與I型膠原，重量比為2∶1，將材料制成直徑6mm，厚度1mm 的圓片，包裝后鈷60輻照消毒備用。DMEM/F12培養(yǎng)液由美國Hyclon公司提供。成骨誘導液成分為含10%FBS的DMEM 培養(yǎng)液，10mmol/Lβ 甘油磷酸鈉，0.05mmol/L維生素C和100mm ol/L地塞米松。

1.2兔BMSCs的獲取、分離、傳代擴增與成骨誘導 參照文獻，定位坐骨穿刺點[5]。兔常規(guī)備皮，消毒，全身麻醉后，在無菌條件下使用16號骨穿針在坐骨處穿刺，約得1m l左右紅色液體即拔出骨穿針，肝素抗凝，操作過程注意避免細菌污染。采用全骨髓培養(yǎng)法進行原代培養(yǎng)。兔骨髓接種后20－48h根據細胞貼壁情況首次換液。以后每3－4d換液，細胞生長匯合達到70－80%時胰酶加乙二胺四乙酸(Ethy lene Diam ine Tetraacetic Acid,EDTA)消化，1∶2傳代。

取上述3－4代細胞爬片，成骨誘導液培養(yǎng)7天后取出，丙酮4℃固定30m in后取出，入堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)孵育液，未誘導細胞做為空白對照。

取上述3－4代細胞爬片，成骨誘導液培養(yǎng)21天后取出，丙酮4℃固定30m in后，結節(jié)2%茜素紅染色。未誘導細胞做為空白對照。

1.3兔BMSCs與NβTCP/Co-復合物修復兔頜骨缺損 將獲得的兔BMSCs傳至第三代，EDTA＋胰酶消化后，用含有10g/L甘氨酸的DMEM/F12培養(yǎng)液調整細胞濃度至2×107個/m l。根據前期研究成果，該濃度的甘氨酸既可有效拮抗人工骨制備過程中殘留的戊二醛的細胞毒性，又不明顯抑制細胞的生長。使種子細胞與支架材料復合良好。用5m l無菌注射器吸取配置好的細胞懸液，小心滴加至人工骨表面，兩片人工骨共約滴加懸液0.5m l左右。每只動物制備3片人工骨種子細胞復合體。放入24孔培養(yǎng)板用同種培養(yǎng)液培養(yǎng)3d后，取出一片吸干液體后滴加少量噻唑藍[(3-(4,5-dimethy lthiazol-2-y l)-2,5-dipheny ltetrazolium brom ide,MTT]，10m in后，觀察材料如果變?yōu)樗{色，提示有活細胞存在。則將剩余兩片人工骨種子細胞復合體做自體動物回植。動物分組采用自身對照方法，在兩只兔雙側下頜骨各制備10mm×8mm大小箱狀人工骨缺損，修整植入體外形以使其能夠嚴密充填骨缺損腔。實驗側植入人工骨種子細胞復合體，對照側植入單純NβTCP/Co。10w 后處死實驗動物，觀察成骨效果。

2.結果

2.1抽取的兔骨髓接種在培養(yǎng)皿內即刻，見少許單核細胞，圓形，未貼壁(圖1a)。24h左右，可見少量細胞開始貼壁，并伸展變形(圖1b)。之后細胞漸增多，呈梭狀(圖1c、d)。原代細胞培養(yǎng)14d左右可以進行傳代。隨著傳代增加，細胞生長速度漸漸加快，3-4代時，細胞同一性較好，生長活躍；但當傳至10代以后，生長速度下降，出現老化現象。

圖1 兔紅骨髓倒置相差顯微鏡下圖像

2.2 ALP染色及茜素紅染色 成骨誘導后的細胞ALP染色鏡下見棕黑色沉淀物，位于細胞內。未誘導的細胞未見明顯黑色沉淀，ALP染色著色不明顯(見圖2)。2%茜素紅染色鏡下可見大量棕紅色鈣化結節(jié)形成，結節(jié)附著于培養(yǎng)板底壁，不能移動(見圖3)?？梢姵晒钦T導后(a)大量棕黑色物質位于細胞內，未誘導細胞(b)未見明顯棕黑色沉淀物。

圖2 兔BMSCs3-4代細胞ALP染色鏡下圖像

圖3 兔BMSCs3-4代細胞2%茜素紅染色鏡下圖像。鏡下可見大量棕紅色鈣化結節(jié)形成，結節(jié)附著于培養(yǎng)板底壁，不能移動。

圖4 10w時兔頜骨標本?？梢娚戏綄嶒灲M皮質骨較為光滑、連續(xù)，與周圍骨質相似；下方對照側較多索條狀新生骨，與周圍骨質區(qū)別明顯。

2.3頜骨標本肉眼觀察 10w 時，骨缺損表面均已完全骨性修復，但實驗側骨外形比對照側豐滿，表面骨皮質比較光滑、連續(xù)。對照側骨缺損大部愈合，但表面骨皮質仍有不連續(xù)處，原骨缺損區(qū)表面骨質不光滑(圖4)。

2.4頜骨標本組織切片觀察 兩側均可見原缺損區(qū)有骨質出現，內部均可見少量支架材料殘余。(圖5、圖6)。

圖5 10w時兔頜骨組織切片

圖6 10w時兔頜骨組織切片

3.討論

兔BMSCs與NβTCP/Co構建的人工骨修復兔頜骨缺損，10w時骨外形比對照側豐滿，與周圍正常骨質外形相似；而對照側尚有許多索條狀新生骨，外形與周圍骨質差別明顯，處于骨改建過程中，實驗結果證實了骨髓間充質細胞對成骨的促進作用。分析其原因可能為：具有一定濃度的BMSCs植入骨缺損區(qū)后可以向成骨細胞方向分化，從而保證早期就有充足的成骨細胞參與成骨，加速了成骨的過程，在相同時間內成骨量要多于單純人工骨植入組。提示在臨床中β－磷酸三鈣/膠原與人自體骨髓間充質細胞復合后可以加速成骨過程。

鄂玲玲，劉洪臣等[6]曾在兔下頜牙槽骨制備10×4×3mm骨缺損，術后12w未見明顯新生骨形成，認為其為一種極限骨缺損模型。Schm itz，JP[7]和Thomaidis，V[8]報道兔頜骨極限缺損的尺寸大于等5mm。因此，本實驗所用骨缺損模型可認為是一種極限骨缺損。在前期研究中，單純β-磷酸三鈣/膠原復合體在12w時可以完全修復同類型兔頜骨缺損?；诒M量減少使用實驗動物數量的原則，我們選擇只在10w時觀察成骨效果，以便于較為敏感的觀察種子細胞的作用。

本實驗采用了口外入路的下頜骨中部箱型骨缺損模型，成骨影響因素相對較少，便于分析；不與口腔相通，便于無菌操作；需要時該模型也可以包含牙周組織。該處骨結構與人下頜骨體部類似，為雙層皮質骨，內為松質骨，且含有牙周結構。去除頰面皮質骨后很容易制備成箱型植骨床，易于填充缺損區(qū)，且不需要輔助固位技術，影響成骨的因素除植骨材料外相對較少,易于檢驗人工骨的效果。兔下頜骨缺損的具體位置有不同報道，2002年胡秀蓮，林野等[9]采用位于下頜角，相當于升支處的洞穿型骨缺損，實驗結果表明該處5mm×5mm洞穿骨缺損無法自愈，使用可吸收膜后成骨也欠理想。推測其原因可能為該處骨質菲薄，為厚度不足0.5mm的皮質骨，且兩邊為強大的咀嚼肌，難以形成足夠的植骨間隙。我們前期的實驗也證明采用該種缺損模型成骨量較少，難以定量分析，且成骨效果不穩(wěn)定[10]。

對于骨組織工程的最適種子細胞濃度目前不同學者間尚未達成共識[11-13]。大量高密度種子細胞的接種對于構建組織的結構維持與功能發(fā)揮是至關重要的[14]，但是種子細胞接種密度也不是越高越好。密度過高會造成細胞的過度堆積，營養(yǎng)供給不良導致過量細胞死亡，造成種子細胞的浪費。這一點在較大體積骨缺損的修復中尤其重要。同時也要考慮生物材料吸水性的不同而調整細胞密度。比如同體積的聚乳酸與殼聚糖生物材料，因聚乳酸吸水性較好，如果接種時細胞懸液的濃度相同，必然會造成聚乳酸因吸收較多的液體而在相同體積的材料內容納了較多的細胞，此時可以將細胞懸液的濃度適當較低一些。有研究證明，單位重量脫鈣骨對骨髓間充質干細胞的最大黏附數量為3.5×107/g，接種細胞濃度在5×105/m l時黏附率最高[15]。這可以作為一個參考的基準。本實驗選擇的種子細胞濃度為2×107個/m l，是綜合考慮能夠獲得的種子細胞數量，所用支架材料的性能，以及頜骨良好的血供。實驗結果證實該濃度的種子細胞顯示出良好的促進骨愈合的作用。

3－4代骨髓間充質干細胞體外成骨誘導后，鈣化結節(jié)及ALP染色與誘導前比較明顯增強，提示獲取的兔骨髓間充質干細胞可以向成骨細胞方向分化，可以用于體內成骨實驗。該結果與其他學者研究結果相同[16,17]。

文獻報道的兔骨髓穿刺的部位可以有股骨、脛骨、髂骨及坐骨。采用股骨等長骨部位的實驗較多，髂骨也有報道，坐骨少見。在前期的實驗中發(fā)現，髂骨是可以提取出骨髓間充質細胞的，但是因為髂骨較薄，操作過程中落空感不明顯，骨穿針較易穿透整個髂骨造成失敗。而坐骨不僅同為不規(guī)則骨，且較髂骨為厚，并且有可以體表定位的骨性解剖標志，選擇坐骨做為骨髓穿刺的位置，針刺時落空感明顯，可抽取所需的骨髓量，最終結果證實取材滿意，達到實驗要求。因此坐骨是較好的兔骨髓穿刺部位。

Nβ-TCP/Co結合兔BMSCs對于更大骨缺損修復能力尚有待檢驗。

綜上所述，兔BMSCs與Nβ-TCP/Co結合后回植入兔頜骨人工骨缺損區(qū)后，可以良好成骨，成骨較單純納米β-磷酸三鈣/膠原復合體好。

[1] 朱建華，馬珊珊，李慕勤，等.新型骨支架復合材料修復牙槽骨缺損研究[J].口腔醫(yī)學研究，2012(8)：767-771

[2] 楊世茂，王明國，李 靜，等.復合ADSCs/β-TCP組織工程骨與PRF修復下頜骨缺損的實驗研究[J].實用口腔醫(yī)學雜志，2012(6)：686-690

[3] Zou C,WengW,Deng X,etal.Preparation and characterization of porous beta-tricalcium phosphate/collagen compositeswith an integrated structure[J].Biomaterials,2005，26(26)：5276-5284

[4] 劉星綱，鄧旭亮，梅 芳，等.甘氨酸對新型膠原基人工骨材料細胞毒性影響的體外研究[J].北京口腔醫(yī)學，2007(2)：78-80

[5] 劉丹平，胡蘊玉，施新猷，等.穿刺抽取兔骨髓的方法[J].第四軍醫(yī)大學學報，2000(6)：741-744

[6] 鄂玲玲，王東勝，師占平，等.一種新型的兔牙槽骨缺損模型的建立[J].中華老年口腔醫(yī)學雜志，2011，9(3)：137-140，171

[7] Schm itz J P,Hollinger J O.The critical size defect as an experimentalmodel for craniomandibulofacial nonunions[J].Clin Orthop RelatRes，1986(205)：299-308

[8] ThomaidisV,Kazakos K,LyrasDN,etal.Comparative study of 5 different membranes for guided bone regeneration of rabbit mandibular defects beyond critical size[J].Med Sci Monit,2008，14(4)：R67-R73

[9] 胡秀蓮，邱立新，林 野，等.可吸收性Bio-Gide膜治療下頜角區(qū)局部骨缺損實驗研究[J].中國口腔種植學雜志，2002(1)：10-12

[10]劉星綱，翁文劍，鄧旭亮，等.納米β-磷酸三鈣/膠原復合體修復兔頜骨缺損的研究[J].口腔醫(yī)學，2005(4)：196-197

[11]李春明，楊春艷，劉寶林，等.骨髓基質細胞復合多孔礦化Bio-Oss骨膠原移植修復下頜骨缺損的實驗研究[J].實用口腔醫(yī)學雜志，2005(3)：352-355

[12]李 智，李祖兵.骨髓來源成骨細胞復合脫鈣骨修復頜骨缺損的實驗研究[J].中華口腔醫(yī)學雜志，2005(5)：83

[13]袁 捷，祝 聯，王 敏，等.自體骨髓基質干細胞-珊瑚羥基磷灰石修復下頜骨節(jié)段缺損的實驗研究[J].中華口腔醫(yī)學雜志,2006(2)：94-97

[14]組織工程學理論與實踐[M].上?？茖W技術出版社，2004.360

[15]柴 崗，張 艷，王 敏，等.人骨髓基質細胞誘導成骨細胞和脫鈣骨粘附率的研究[J].實用美容整形外科雜志，2003(2)：66-69

[16]陳小菊，王 嫣，王 蘭，等.誘導骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化的實驗研究[J].重慶醫(yī)學，2009(10)：1185-1187.

[17]田少奇，王 麗，孫 康，等.人臍血間充質干細胞的分離培養(yǎng)及其多向分化潛能的實驗研究[J].中國骨與關節(jié)損傷雜志，2009(2)：108-111