孫東良 張勝強 于靈靈

河北省唐山市唐海縣醫(yī)院神經(jīng)外科，河北唐山 063200

大鼠切除卵巢（OVX）模型與絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥最為相似，OVX大鼠由于骨量丟失，椎間盤應(yīng)力發(fā)生變化，從而導(dǎo)致椎間盤退化，但確切的分子機制還不很清楚，因此，本實驗建立OVX大鼠OP模型，通過組織學(xué)、形態(tài)學(xué)及相關(guān)因子的觀察探討椎間盤退變的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選擇健康3月齡雌性SD大鼠30只，體重（210±32）g（河北聯(lián)合大學(xué)實驗動物中心，Ⅱ級）。按體重隨機分為三組，每組10只，其中，基礎(chǔ)對照（BL）組，實驗前處死大鼠取標(biāo)本；去卵巢手術(shù)（OVX）組采用10 mL/L戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，在無菌條件下大鼠行背部入路雙側(cè)卵巢切除手術(shù)；假手術(shù)（sham）組大鼠暴露卵巢但不切除。術(shù)后3 d每日1次肌注青霉素20萬單位/只，所有大鼠在同等條件下飼養(yǎng)，喂養(yǎng)12周后脫頸椎處死，處死前第10天和第4天分別皮下注射鹽酸四環(huán)素（30 mg/kg）和鈣黃綠素（6 mg/kg）。

1.2 標(biāo)本處理

分別按“1.1”中時段對動物進行脫頸椎處死，切開大鼠背部皮膚，銳刀分離所有的軟組織，切除棘突、橫突等附件組織，切取L2椎體，用低速鋸在近端作矢狀面剖開骨髓腔，置于10%福爾馬林中性緩沖液中準(zhǔn)備硬組織切片，L4～5椎體及椎間盤置于10%福爾馬林中性緩沖液中準(zhǔn)備行HE常規(guī)染色、特殊染色及免疫組化。

1.3 硬組織切片制作

將刀片和標(biāo)本塊用40%的酒精適當(dāng)浸潤，碳化鎢鋼刀控制切片速度，用軟毛刷和把針將切片放置載玻片展平，用75%酒精將載玻片適當(dāng)濕潤，放置塑料薄膜，酒精紙吸干多余的酒精，推壓切片使之進一步平整、貼附，加蓋一張載玻片保護首片，置于40℃～50℃烤箱中過夜，次日晨取出，熒光標(biāo)記切片避光保存，每個標(biāo)本切3張片，其中，兩張進行VonKossa、Gemisa染色，另一張行熒光指標(biāo)測量，并采用Leica Dmlb2熒光/光學(xué)顯微鏡及LeicaDC300數(shù)碼攝像系統(tǒng)進行觀察并攝取圖像。

1.4 VG特殊染色方法

組織常規(guī)脫蠟至水，采用Weiger鐵蘇木素染液染5～10 min，稍水洗，1%鹽酸酒精迅速分化，流水沖洗數(shù)分鐘；VanGieson染液染1～2 min，傾去染液直接用95%的酒精急速分化數(shù)秒，無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.5 椎間盤退變程度評分

根據(jù)Wang等[1]的評分方法對大鼠的退變椎間盤進行評分。見表1。

表1 腰椎間盤組織學(xué)評分

1.6 骨密度測量

①應(yīng)用Norland-XR36雙能X線骨密度測量儀（DEXA，美國），采用小物體掃描模式，準(zhǔn)確度為0.01%，掃描速度為60 mm/s，分辨率（resolution）為1.0 mm×1.0 mm，掃描寬度為5.0 cm的參數(shù)值，進行L2～4腰椎整體骨密度的測量。②為了評價精確度，隨機選取1例，在位置不變的情況下，連續(xù)測量tBMD 5次。③精確度用變異系數(shù)（CV）表示。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)建立EXCEL數(shù)據(jù)庫，采用SPSS 11.5統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組數(shù)據(jù)經(jīng)過Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗和Bartlett方差齊次檢驗后，利用單因素方差分析（ANOVA）和t檢驗比較各組之間的差異，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各實驗組大鼠骨密度比較

骨密度測量的CV值為0.51%，這與Wang等[1]測量的精確度基本一致。OVX組較sham組骨密度顯著下降（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠骨密度比較（±s）

表2 各組大鼠骨密度比較（±s）

注：與sham組比較，aP＜0.05

組 別 只數(shù) L2～4 BL組sham組OVX組10 10 10 0.0876±0.018a 0.1489±0.009 0.1324±0.008a

2.2 骨形態(tài)計量學(xué)比較

與sham組相比，OVX組大鼠的靜態(tài)骨形態(tài)學(xué)的骨量指標(biāo)顯著性下降（BV/TV和Tb.N），而骨小梁分離度（Tb.Sp）和反映破骨細胞指標(biāo)的Oc.No/BV和Oc.Pm/BS顯著性提高（表3）；反映礦化骨表面（MS/BS）和骨形成率（MAR，BFR/BS和BFR/BV）的動態(tài)指標(biāo)，OVX組明顯高于sham組（表4）。

表3 兩組椎體松質(zhì)骨靜態(tài)骨形態(tài)計量學(xué)指標(biāo)比較（±s）

表3 兩組椎體松質(zhì)骨靜態(tài)骨形態(tài)計量學(xué)指標(biāo)比較（±s）

注：與sham組比較，aP＜0.05

組別 只數(shù) BV/TV（%）Tb.N（/mm）Tb.Th（μm）Tb.Sp（μm）Oc.No/BV（/mm2）Oc.Pm/BS（%）sham組OVX組10 10 18.98±3.77 8.86±2.67a 2.73±0.47 1.24±0.36a 74.67±6.46 68.22±7.13 305.57±65.4 779.38±31.25a 8.76±0.70 12.48±1.30a 0.40±0.03 0.64±0.10a

表4 兩組椎體的松質(zhì)骨動態(tài)骨形態(tài)計量學(xué)指標(biāo)（±s）

表4 兩組椎體的松質(zhì)骨動態(tài)骨形態(tài)計量學(xué)指標(biāo)（±s）

注：與sham組比較，aP＜0.05

組別 只數(shù) sL.Pm（mm）dL.Pm（mm）MS/BS（%）MAR（μm/d）BFR/B（μm/d×100）BFR/BV（%year）sham組OVX組10 10 2.13±0.86 1.44±0.28 0.98±0.11 0.62±0.27a 5.45±1.34 7.46±3.54a 1.35±0.13 1.98±0.10a 9.25±3.13 15.22±7.36a 79.54±33.47 116.60±38.76a

2.3 組織學(xué)表現(xiàn)和椎間盤組織學(xué)評分

BL組軟骨細胞分層排列清晰，關(guān)節(jié)軟骨終板由多層成熟軟骨細胞組成的透明軟骨，胞質(zhì)豐富，髓核由大量細胞核清晰的脊索細胞組成，主要集中在髓核中部，纖維環(huán)膠原纖維排列規(guī)則，內(nèi)層纖維環(huán)較薄。sham組軟骨細胞排列規(guī)則，與椎體相鄰部有大量軟骨組織舌樣突出，關(guān)節(jié)軟骨終板透明，組織結(jié)構(gòu)清晰，細胞排列有序，軟骨陷窩存在，與繼發(fā)性骨化中心相連的透明軟骨鈣化，潮標(biāo)清晰可見，雖然較BL組出現(xiàn)軟骨下骨班板增厚和部分軟骨終板骨化，但軟骨終板內(nèi)分布有大量粗大的血管，髓核內(nèi)脊髓細胞呈羽毛狀或團塊樣分布，細胞形態(tài)完整，纖維環(huán)內(nèi)層纖維軟骨較BL組有顯著的增生變厚，外層纖維環(huán)膠原纖維排列規(guī)則。OVX組關(guān)節(jié)軟骨終板成熟軟骨細胞變性壞死，數(shù)量較對照組減少，細胞排列紊亂，關(guān)節(jié)軟骨終板厚度變薄，在軟骨終板和髓核之間的過渡區(qū)內(nèi)的軟骨細胞被纖維環(huán)內(nèi)層增生的纖維軟骨細胞所代替，基質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量排列的膠原纖維，在靠近次級骨化中心的關(guān)節(jié)軟骨基底層出現(xiàn)大量增生活躍的小軟骨細胞，次級骨化中心增生并向終板中央侵入，使透明軟骨終板面積減少，骨化增加，增厚的骨板血管腔明顯減少，與之毗鄰的髓核脊索細胞明顯減少，被軟骨樣細胞取代或發(fā)生黏液樣變。

sham組、OVX組椎間盤組織學(xué)評分較BL組顯著性提高（P＜0.05），OVX組的評分較sham組提高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表5。

2.4 MMP-13、IL-1蛋白表達情況

光鏡下觀察顯示，MMP-13蛋白的表達在胞漿，呈棕黃色顆粒狀，OVX組的表達明顯高于sham組和BL組（P＜0.05），sham表達組高于BL組，但兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。免疫組化平均灰度值結(jié)果，見表6。

表5 各組大鼠椎間盤組織學(xué)評分比較（±s）

表5 各組大鼠椎間盤組織學(xué)評分比較（±s）

注：與BL組比較，aP＜0.05；bP＜0.05

組別 只 數(shù) L4～5 BL組sham組OVX組10 10 10 0.10±0.28 1.48±0.67a 4.55±1.34a

表6 MMP-13、IL-1蛋白表達情況（±s）

表6 MMP-13、IL-1蛋白表達情況（±s）

注：與sham組比較，aP＜0.05

組別 只數(shù) MMP-13 IL-1 BL組Sham組OVX組10 10 10 229.3±7.289 220.2±5.545 179.6±6.438a 215.7±8.664 210.1±3.785 151.5±7.438a

3 討論

3.1 雌激素與椎間盤退變

多項研究證實，雌激素缺乏使破骨細胞的功能處于活躍狀態(tài)，破骨增強，成骨細胞的功能由于缺乏雌激素的刺激處于部分抑制狀態(tài)，導(dǎo)致骨代謝轉(zhuǎn)換率增加，由此帶來骨的分解代謝，使骨小梁變薄變細，其結(jié)果為骨組織減少，引起骨質(zhì)疏松。雌激素可抑制由成骨細胞產(chǎn)生IL-1、TNF-α、IL-6等炎性因子對破骨細胞的增殖、分化和活化[2]。在失去雌激素的作用后，軟骨骨基質(zhì)成分減少，軟骨細胞合成Ⅱ型膠原的能力下降，整個軟骨層產(chǎn)生退變現(xiàn)象。同時破骨細胞大量生成，吞噬軟骨下骨，使骨小梁變細，排列紊亂，使骨的強度下降。鈣化軟骨層出現(xiàn)破骨細胞，可能是加速軟骨退變的主要因素之一[3]。OVX大鼠由于骨量丟失，椎間盤應(yīng)力發(fā)生變化，從而導(dǎo)致椎間盤退化。

本研究結(jié)果表明：OVX組SD大鼠的子宮體和子宮角較sham組明顯萎縮，發(fā)育不全；大鼠腰椎骨密度的變化顯示，OVX組椎體骨量下降，成功復(fù)制了卵巢切除大鼠骨質(zhì)疏松動物模型，并驗證卵巢切除大鼠的骨量丟失是由于雌激素缺乏導(dǎo)致骨形成和骨吸收均明顯增加，但破骨細胞活力增強，導(dǎo)致骨吸收大于骨形成，使骨量丟失。本研究發(fā)現(xiàn)：OVX組大鼠腰椎間盤發(fā)生嚴(yán)重退變，表現(xiàn)在椎間盤髓核脊索細胞數(shù)量減少，出現(xiàn)軟骨樣細胞，髓核黏液變，裂隙生成，軟骨終板變薄，軟骨細胞數(shù)量減少、鈣化，甚至完全骨化，纖維環(huán)后部結(jié)構(gòu)排列紊亂，厚度變薄，間隙增寬，椎體邊緣骨贅增生，椎間盤組織學(xué)評分提高。

3.2 MMP-13、IL-1與椎間盤退變

MMP-13主要來源于軟骨細胞，主要降解Ⅱ型膠原。雖然都是膠原酶，但是MMP-13對Ⅱ型膠原的催化效率大概是MMP-1對Ⅱ型膠原催化效率的5倍。MMP-13在退變椎間盤中的表達增強機制目前還不清楚，但是一系列的研究結(jié)果提示，MMP-13在椎間盤中的表達受到多方面因素的調(diào)節(jié)。以前的研究己經(jīng)證明應(yīng)力負(fù)荷可以誘發(fā)椎間盤退變，而最近的很多研究提示應(yīng)力負(fù)荷可能與椎間盤退變中MMP-13的表達增強有關(guān)。MMP-13與椎間盤內(nèi)的其他作用也可能具有協(xié)同效應(yīng)，產(chǎn)生放大作用。有實驗證實在人的正常椎間盤內(nèi)存在MMP-2、MMP-3的表達，而且在退變椎間盤中MMP-2、MMP-3的 表 達 更 為 明 顯。而MMP-2、MMP-3可 以 提 高MMP-13的活性，因此，它們之間可能具有一定的協(xié)同作用。國外學(xué)者在動物及人體實驗中發(fā)現(xiàn)，退變椎間盤的MMP-13陽性率明顯較正常椎間盤高[4-5]。正是因為MMP-13對軟骨細胞的Ⅱ型膠原有重要的降解作用，所以研究其在椎間盤退變中的表達可能具有重要意義。本實驗結(jié)果有力地支持了這一設(shè)想。本實驗結(jié)果表明：退變腰椎間盤中MMP-13的蛋白表達較對照組明顯增強，說明MMP-13在腰椎間盤退變中具有重要調(diào)節(jié)作用。

IL-1是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵酶，可促進前列腺素、白三烯、血栓素、血小板活化因子等重要炎性介質(zhì)的分泌，另外以通過酶解細胞膜磷脂，可直接造成細胞膜損害。IL-1可促進體外培養(yǎng)的椎間盤細胞產(chǎn)生PGE2且呈一定程度的劑量依賴關(guān)系，后者被認(rèn)為在疼痛產(chǎn)生中起到相當(dāng)重要的作用。另外IL-1又可影響基質(zhì)中的蛋白多糖的代謝，小劑量的IL-1對軟骨基質(zhì)中的蛋白多糖的合成具有抑制作用，而較大劑量對蛋白多糖的降解具有刺激作用。Shinmei等[6]用免疫組化方法觀察到退行性骨關(guān)節(jié)病患者軟骨IL-1染色為陽性反應(yīng)。本實驗結(jié)果也顯示，OVX大鼠椎間盤組織中IL-1表達高于其他組。

MMP-13、IL-1在退變椎間盤中表達增強的機制目前還不清楚，在椎間盤退變過程中，MMP-13、IL-1分別起到了重要的作用，很多研究也證實了MMP-13、IL-1是椎間盤基質(zhì)分解的重要因子，MAPKs家族中的P38和NF-κB在MMPs合成過程中發(fā)揮重要作用，并可能在椎間盤退變病程中發(fā)揮重要作用，證實椎間盤退變可能為細胞因子的減少和致炎因子增多導(dǎo)致MMPS活性增加，加劇細胞退變。IL-1是MMP-13的有效誘導(dǎo)劑，IL-1使處理過的椎間盤細胞中MMP-13的基因表達增強，Ⅱ型膠原基因表達下降[7]。

綜上所述，本實驗證實了MMP-13、IL-1表達的增加是椎間盤退變的重要因素，為臨床治療提供了理論依據(jù)，但具體的信號傳導(dǎo)途徑還有待于進一步研究。

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