吳運梅, 張麗紅, 王國秀

(華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)湖北省重點實驗室, 湖北 武漢 430079)

中華卵索線蟲雌雄寄生后期幼蟲基因差異表達分析

吳運梅, 張麗紅, 王國秀*

(華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)湖北省重點實驗室, 湖北 武漢 430079)

索科線蟲是一類具有很大生防潛力的昆蟲(如棉鈴蟲等)天敵資源, 但由于其體外培養(yǎng)尚未獲得成功,阻礙了商業(yè)化生產(chǎn)和大規(guī)模應(yīng)用, 究其原因主要是體外培養(yǎng)的線蟲不能完成雌雄性別分化。因此, 研究該類線蟲性別分化機制成為近年本領(lǐng)域的熱點課題。該文以中華卵索線蟲為實驗材料, 采用mRNA差異顯示的方法,分析了中華卵索線蟲性別分化關(guān)鍵時期雌、雄寄生后期幼線蟲的基因表達差異。在雌雄線蟲體內(nèi)得到具有表達差異的基因片段20條。其中8條在雄蟲體內(nèi)特異性表達, 12條在雌蟲體內(nèi)特異性表達。利用信息生物學(xué)技術(shù)對所分離到的差異片段進行了序列分析。其中, Ensembl分析發(fā)現(xiàn)4個片段與秀麗線蟲X染色體具有可匹配片段, 推測這些片段可能是影響中華卵索線蟲性別分化的重要基因。這些結(jié)果將為后續(xù)研究提供思路。

昆蟲病原索科線蟲; 性別分化; mRNA差異顯示

中華卵索線蟲(Ovomermis sinensisChen)是昆蟲病原索科線蟲的一種, 屬無尾感器綱(Aphasmidia)嘴刺目(Enoplida)索線蟲科(Mermithidae)卵索屬(Ovomermis)(Chen et al, 1991), 廣泛寄生于鱗翅目昆蟲體內(nèi), 如斜紋夜蛾、甜菜夜蛾、菜青蟲、黃地老虎、小地老虎及棉鈴蟲等，其感染期幼線蟲可主動尋找并侵染宿主, 寄生后導(dǎo)致宿主不育, 并因脫出使宿主體壁破裂而死亡。因此, 害蟲的寄生率即等于其死亡率 (Zhong & Wang, 2001), 生防潛力極大。由于索科線蟲在自然界的分布和數(shù)量有限, 加之近年化學(xué)農(nóng)藥在蔬菜和糧棉油等作物生產(chǎn)上的廣泛使用, 在殺死昆蟲的同時, 也使農(nóng)田害蟲天敵資源受到很大殺傷, 甚至導(dǎo)致某些昆蟲天敵有消失滅種的危險, 在害蟲高發(fā)的季節(jié)更是難有足夠線蟲資源量與之匹配而起到生物防治的效果。為解決這一問題, 近年國內(nèi)、外有關(guān)學(xué)者試圖模擬昆蟲體內(nèi)血淋巴環(huán)境體外培養(yǎng)索科線蟲, 但均未獲得成功(Wang et al, 2001), 其主要原因是培養(yǎng)的線蟲不能完成性別分化及成熟。因此, 對昆蟲病原索科線蟲性別分化機制的研究不僅具有重要的理論意義, 而且具有重大的應(yīng)用價值。

目前, 對索科線蟲性別分化機制的研究, 主要停留在形態(tài)學(xué)、組織學(xué)和生理生化等方面(Li et al,2006), 對其分子機理的探討尚處在起步階段。He et al (2009)和Ren et al (2011a, b)分別克隆了性別決定關(guān)鍵基因tra-1部分片段和性腺發(fā)育相關(guān)基因vasa全長 cDNA 序列; Gao et al (2004)通過mRNA差異顯示技術(shù)和雙向電泳技術(shù)分別從轉(zhuǎn)錄和蛋白水平對雌雄成蟲的基因表達進行了分析,發(fā)現(xiàn)雌雄成蟲基因表達在 RNA和蛋白水平均存在明顯差異, 但由于當(dāng)時實驗條件的限制, 他們并未進行更深入的研究。然而, 基于近年生理生化和形態(tài)學(xué)研究進展, 發(fā)現(xiàn)寄生后期線蟲是其性腺發(fā)生和分化的重要時期 (Li et al, 2006), 研究該時期線蟲的基因表達狀況對于了解中華卵索線蟲的性別分化機制具有重要意義, 但對該時期的研究迄今仍很匱乏。因此, 為了解線蟲性腺發(fā)育的分子機制, 分析雌雄線蟲性腺發(fā)育關(guān)鍵時期基因表達差異, 在查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻的基礎(chǔ)上, 本研究利用mRNA差異表達技術(shù), 分析了寄生后期早期階段雌、雄幼蟲的基因表達差異, 并利用24對引物對該時期的雌雄蟲的全部mRNA進行篩查, 試圖分離到線蟲性腺發(fā)育關(guān)鍵期雌雄蟲的差異表達基因片段,從而為探明中華卵索線蟲性別分化機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 中華卵索線蟲采自河南省上蔡縣麥田, 利用宿主棉鈴蟲在本實驗室長期傳代培養(yǎng)備用。

1.1.2 主要試劑 PMD 18-T、Rnase-Free DNase、T4 DNA Ligation Kit、T4 DNA Ligase、Primerscript reverse transcriptase載體購自 TaKaRa公司;E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit購自O(shè)mega bio-tek;Taq DNA polymerase購自Fermentas公司; TRIZOL REAGENT購自Invitrogen公司。其它試劑均為分析純, 購自國內(nèi)化學(xué)試劑公司。

1.1.3 引物序列 3' 錨定引物：① H-T11A: 5'-AAGCTTTTTTTTTTTA-3'; ② H-T11C: 5'-AAGCT TTTTTTTTTTC-3'; ③ H-T11G: 5'-AAGCTTTTTT TTTTTG-3'。

5' 隨機引物：① H-AP1: 5'-AAGCTTGATT GCC-3'; ② H-AP2: 5'-AAGCTT CGACT GT-3'; ③H-AP3: 5'-AAGCTTTGGTCAG-3'; ④ H-AP4: 5'-AAGCTTCTCAACG-3'; ⑤ H-AP5: 5'-AAGCTTA GTAGGC-3'; ⑥ H-AP6: 5'-AAGCTTGCAC CAT-3';⑦ H-AP7: 5'-AAGCTTAACGAGG-3'; ⑧ H-AP8:5'-AAG CTTTTACCG C-3'。

1.2 實驗方法

1.2.1 中華卵索線蟲雌、雄寄生后期幼線蟲的獲取取中華卵索線蟲感染期幼蟲, 按線蟲與宿主 100:1和 5:1的比例分別感染棉鈴蟲, 收集不同時間自然脫出的雌、雄寄生后期幼線蟲, 無菌水洗凈后置于潮濕沙子中, 放入26 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

培養(yǎng)5 d后取出, 于超凈工作臺中用DEPC水清洗凈, 然后取適量裝入DEPC處理過的EP管中,液氮速凍后, 置于?80 ℃冰箱備用。

1.2.2 中華卵索線蟲 RNA的制備 按 Trizol試劑使用說明并結(jié)合本實驗材料的特點, 分別提取雌、雄中華卵索線蟲寄生后期幼蟲的總RNA。

1.2.3 RNA中痕量基因組 DNA的去除 利用RNase-free DNase I去除殘留的中華卵索線蟲基因組DNA, RNA的完整性通過瓊脂糖凝膠電泳檢測,利用分光光度計檢測 RNA的濃度和純度。分別以經(jīng)過DNase I處理的RNA、RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA、超純水?dāng)U增actin基因, 其中cDNA作為陽性對照,超純水作為陰性對照, 檢測DNA是否完全去除。

1.2.4 mRNA差異顯示 PCR cDNA第一鏈的合成：在 0.2 mL離心管中依次加入：錨釘引物(20 μmol/L)1 μL, dNTP(10 mmol/L)1 μL, 中華卵索線蟲總 RNA 2 μg, RNase-free水補至 14 μL; 然后 PCR儀中65 ℃處理10 min, 立即冰浴1 min; 稍離心后,加入 RNase Inhibitor(40 U/μL)1 μL, 5×First-Strand Buffer 4 μL; 混勻, 稍離心, PCR 儀中42 ℃ 溫育 2 min; 加入 1 μL primscript reverse transcriptase (200 U, 購自 TaKaRa公司); 輕輕混勻后, PCR儀中42℃ 溫育50 min; PCR儀中70 ℃處理15 min以滅活反轉(zhuǎn)錄酶; 立即進行第二鏈的合成或?20 ℃保存。

cDNA第二鏈的合成：在0.2 mL離心管中加入第一鏈錨釘引物(20 μmol/L)1 μL, 第二鏈隨機引物(20 μmol/L)1 μL, cDNA 第一鏈產(chǎn)物 2 μL, 10×PCR緩沖液 2 μL, 10 mmol/L dNTPs 0.4 μL, 25 mmol/L MgCl21.4 μL, 無菌水補至 19 μL; PCR 儀中, 96 ℃處理10 min后, 36 ℃處理15 min; 然后加入1 μL Taq酶(1 U/μL); 按以下程序進行PCR擴增：94 ℃5 min, 94 ℃45 s, 40 ℃2 min, 72 ℃1.5 min, 40 循環(huán),72 ℃10 min; 然后?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 分別取3.5 μL差異顯示PCR產(chǎn)物加入2 μL變性聚丙烯酰胺凝膠上樣緩沖液(95%去離子甲酰胺, 20 mmol/L EDTA,0.05%溴酚蘭, 0.05%二甲苯藍), 95 ℃變性 3 min,然后使用TBE緩沖液在6%的變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳, 400 V電泳大約6 h即可完全分離, 然后取下凝膠, 采用銀染的方法顯色。該方法快速簡便, 分辨率高。

1.2.6 差異cDNA片段的回收 用干凈手術(shù)刀切下雌、雄有表達差異的DNA片段, 放入0.5 mL離心管中; 加入20 μLTE浸泡膠條, 并于95 °C處理20 min, 使凝膠中的DNA片段溶入TE緩沖液。

1.2.7 差異cDNA片段克隆與分析 以浸泡液為模板, 按上述條件對差異片段再擴增; PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收目的片段后, 與 pMD-19T載體連接,然后經(jīng)大腸桿菌轉(zhuǎn)化、篩選后，送樣測序, 所得序列在NCBI和Ensemble上進行比較分析, 初步確定其功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 雌、雄寄生后期幼線蟲的收集

中華卵索線蟲寄生期的營養(yǎng)競爭壓力決定其雌、雄性別分化。當(dāng)感染比率較低時(5:1),營養(yǎng)競爭壓力較小、寄生期的時間較長(＞10 d), 每條線蟲在宿主血淋巴中獲得的營養(yǎng)較多, 所以發(fā)育成的寄生后期幼線蟲蟲體較大, 且基本上都為雌蟲; 而感染率較高時(100:1), 營養(yǎng)競爭壓力較大、寄生期的時間較短(～7 d), 發(fā)育成的寄生后期幼線蟲蟲體較小,且通常都為雄蟲。因此, 根據(jù)感染比例、寄生時間及蟲體大小來區(qū)分并收集雌、雄寄生后期幼線蟲。

2.2 中華卵索線蟲RNA的提取

分別提取雌、雄寄生后期幼線蟲總 RNA, 用Nanodrop分光光度計分別測定其純度與濃度。結(jié)果80 mg線蟲材料大約可得 60 μg的總 RNA,OD260/280和 OD260/230值分別為1.9和2.0左右,瓊脂糖凝膠電泳圖中(圖1)28S、18S和小RNA三條帶均清晰可見。

圖1 中華卵索線蟲總RNAFig. 1 Total RNA of Ovomermis sinensis

2.3 RNA的DNA酶處理

選取濃度和純度均符合要求的雌、雄蟲總RNA樣品, 用DNase I處理, 以除去其中痕量DNA, 以提高實驗準(zhǔn)確性。處理后瓊脂糖凝膠電泳圖中三條帶仍清晰可見, 說明純化后的 RNA仍具有較高完整性; 且以經(jīng)DNase I處理的RNA和陰性對照為模板沒有擴增出actin基因, 而以cDNA為模板的陽性對照可擴增出(圖2)。因此, 可以證明經(jīng)過DNase I處理后的RNA已完全去除了基因組DNA。

圖2 中華卵索線蟲總RNA中殘留基因組DNA的檢測Fig. 2 Detection of DNA in total RNA of Ovomermis sinensis

2.4 差異顯示 PCR

DD-PCR產(chǎn)物在 6%的變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳, 銀染顯示條帶(圖3)。只有同一條件下三個重復(fù)均出現(xiàn)某一條帶, 而相比較的另一條件下均未出現(xiàn)該條帶, 才被認為是差異條帶, 用無菌手術(shù)刀切下。共收集到33條差異條帶。

圖3 部分DD-PCR結(jié)果(箭頭指示差異條帶)Fig. 3 Partial result of DD-PCR (arrows show differential fragments)

2.5 差異cDNA片段的重擴增、克隆與測序

以切下的差異片段洗脫液為模板, 并分別用相應(yīng)的錨釘引物和隨機引物重新擴增差異條帶。33條差異條帶中有 13條重擴增回收失敗, 最終獲得 20條差異條帶。其中8條在雄蟲體內(nèi)特異表達, 12條在雌蟲體內(nèi)特異表達, 此 20條帶經(jīng)測序后獲得其核苷酸序列。

2.6 差異cDNA片段的比對

將所得核苷酸序列在NCBI上進行blastx分析發(fā)現(xiàn), 其中 4 條(雌 G5-4、雌 G8-1、雄 C7-3、雄 C7-4)與已知序列無任何同源性, 余下 16條大多編碼假定蛋白(推測蛋白)(表1)。為進一步了解所分離片段的功能信息, 利用ensembl網(wǎng)站, 分析所得序列與秀麗線蟲等5個物種基因組序列的同源性, 其中10個片段與所比對5個物種基因組序列無任何匹配片段, 其余10個片段比對結(jié)果見表2。其中, 雌G7、雄G8-5、雄C2、雄C7-3 等4個片段與秀麗線蟲X染色體具有同源片段(同源性比例分別為 49%、44.87%、36.49%、33%), 雌 C6-1、雌 G5-3、雌 G5-2、雌A5-1、雄A5-2和雄C8-4分別與果蠅3L染色體、果蠅U染色體、秀麗線蟲Ⅳ號染色體、秀麗線蟲Ⅲ號染色體、秀麗線蟲(包括海鞘及釀酒酵母)的rRNA基因和秀麗線蟲Ⅱ號染色體具有部分同源性。

3 討 論

Li et al (2006)通過石蠟橫切片觀察了中華卵索線蟲生殖腺重要發(fā)育時期形態(tài)變化, 發(fā)現(xiàn)寄生后期幼線蟲在剛從宿主體內(nèi)脫出時其生殖腺極小, 很難觀察到, 滋養(yǎng)物體占滿蟲體整個假體腔; 蛻皮后的雌性成蟲其生殖腺已發(fā)育完全。推測其生殖腺的發(fā)育開始于寄生后期幼線蟲到蛻皮為成蟲這一過程中, 寄生后期是線蟲性腺發(fā)育的關(guān)鍵時期。為此,本研究選擇寄生后期幼線蟲作為差異顯示分析的研究材料。

分析雌、雄線蟲基因表達狀況是探究中華卵索線蟲性別分化機制的重要工作, 但由于該線蟲的生活周期較長, 難于準(zhǔn)確確定線蟲性別分化的具體時期, 目前其遺傳背景也較為欠缺, 通過普通的基因克隆技術(shù)難于獲得性別分化相關(guān)基因, 因此，長期以來這方面的研究進展緩慢。本研究避開這些困難,采用 mRNA差異顯示技術(shù)分析了線蟲性腺發(fā)育關(guān)鍵時期雌、雄線蟲基因的表達差異, 并在本實驗室首次通過該技術(shù)分離到差異表達基因片段, 為后續(xù)研究奠定了良好基礎(chǔ)。

通過mRNA差異顯示技術(shù)共分離到20條雌、雄寄生后期幼蟲差異表達基因片段, 其中8條在雄蟲體內(nèi)特異表達, 12條在雌蟲體內(nèi)特異表達, 通過在NCBI上進行blast分析發(fā)現(xiàn)所分離差異片斷中,有4個序列與已知序列不存在任何同源性, 余下的16條片段大多編碼的為假定蛋白(推測蛋白)。可能原因為實驗材料遺傳背景不詳, 國內(nèi)外對該線蟲及其近源物種分子生物學(xué)研究較少, 數(shù)據(jù)庫上所具有的相似序列較少, 因此，本文所分離的片段大多難以確定其來源和功能。然而, 用Ensembl對所分離到的20條差異序列進行分析時發(fā)現(xiàn)雌G7、雄G8-5、雄C2、雄C7-3等4個片段與秀麗線蟲X染色體具有同源片段。雌G7片段與果蠅中定位于2R染色體上的基因khc-73和秀麗線蟲中定位于X染色體上的基因klp-4同源性都較高(分別為50%和49%), 其中khc-73編碼蛋白kinesin-73、klp-4編碼蛋白KLP-4,且秀麗線蟲中KLP-4和果蠅中kinesin-73為直系同源蛋白, 說明本實驗所分離的中華卵索線蟲的雌G7片段可能與秀麗線蟲中的klp-4基因和果蠅中的khc-73基因為同源基因。而klp-4位于秀麗線蟲X染色體上, 通過RNA干擾技術(shù)發(fā)現(xiàn)KLP-4功能缺失個體并無任何發(fā)育異常, 因此，KLP-4蛋白在秀麗線蟲發(fā)育和行為中扮演的具體角色還未確定(Ensembl網(wǎng)頁)。但是, 基于序列相似性分析, 推測KLP-4可能在神經(jīng)元的發(fā)育和功能方面具有一定作

用。至于該基因是否與線蟲性別分化和性腺發(fā)育有關(guān)還需進一步證實。

表1 差異片段的同源性分析Tab. 1 Homology analyses of DNA fragments derived from DD-PCR products

表2 差異片段的Ensembl分析Tab. 2 Analyses of DNA fragments derived from DD-PCR products by Ensembl website

秀麗線蟲中 X染色體對線蟲的性別分化方向具有重要作用, X染色體上的基因fox-1和sex-1為性別分化方向控制的初始信號(Akerib & Meyer,1994), 它們通過控制性別決定基因xol-1的活性來實現(xiàn)對 X染色體上一系列性別分化級聯(lián)通路基因的控制(Hodgkin, 2002; Large & Mathies, 2007)。由此可見, 秀麗線蟲X染色體在性別分化中具有關(guān)鍵作用, 而通過 ensembl分析, 本文所分離的上述 4條差異表達片段均與秀麗線蟲 X染色體上的片段具有較大同源性, 提示上述四條片段可能與中華卵索線蟲性別分化有關(guān), 但這些片段是否為性別分化關(guān)鍵基因, 尚待進一步研究。

其余所分離的10條片段通過Ensembl分析未發(fā)現(xiàn)與所分析5個物種具有同源性。推測可能為中華卵索線蟲特有或新基因序列, 在后續(xù)研究中可結(jié)合cDNA文庫分離出基因全長進行功能研究, 或作為索科線蟲特有的分子標(biāo)記將為其后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

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Analysis of differentially expressed genes from female and male postparasiticOvomermis sinensisjuveniles

WU Yun-Mei, ZHANG Li-Hong, WANG Guo-Xiu*

(Hubei Key Laboratory of Genetic and Integrative Biology,College of Life Sciences,Huazhong Normal University,Wuhan430079,China)

Mermithidae, as an important natural predator of pests such as Bollworm, has great potential for natural biological control of invasive pests. Unfortunately, theinvitroculture of the nematode has not yet been successful,delaying the commercial application of this pest control method. The key reason for this failure is the inability of the worms to accomplish sex differentiation, sparking a strong interest in this process. Here, we analyzed the differences in gene expression of female and male postparasiticOvomermis sinensisjuveniles by mRNA differential display. In total, 20 gene fragments that had differential expression in male and female worms were isolated, including 8 male- and 12 female-specific ones. Bioinformatics methods were employed to analyze sequences of these fragments, in which ensembl analysis shows 4 fragments have comparable parts withC. elegence’sX chromosome, we speculate those fragments are important genes which influence sex differentiation ofOvomermis sinensis, This data provides an idea for further study of the molecular mechanism of sex differentiation in mermithids.

Mermithidae; Sexual differentiation; mRNA differentially display

Q959.171; Q344.2; S476.15

A

0254-5853-(2012)05-0487-06

10.3724/SP.J.1141.2012.05487

2012-04-05；接受日期：2012-08-31

國家自然科學(xué)基金(30870350)

?通信作者(Corresponding author)，Tel: 027-67862730, Email: wangguoxiu@ yahoo.com.cn

吳運梅, 女, 碩士研究生, 研究方向為動物生化與分子生物學(xué); E-mail: wlaug@163.com