董 麗, 呂龍寶, 賴 仞,*

(1. 中國(guó)科學(xué)院和云南省動(dòng)物模型與人類疾病機(jī)理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所, 云南 昆明 650223;

2. 中國(guó)科學(xué)院研究生院, 北京 100049)

(1. Key Laboratory of Animal Models and Human Diseases Mechanisms of the Chinese Academy of Sciences and Yunnan Province, Kunming Institute of Zoology, the Chinese Academy of Sciences, Kunming 650223, China; 2. Graduate University of the Chinese Academy Sciences, Beijing 100049, China)

樹鼩神經(jīng)肽Y的分子克隆及其靈長(zhǎng)類類似物的同源性比較

董 麗1,2, 呂龍寶1, 賴 仞1,*

(1.中國(guó)科學(xué)院和云南省動(dòng)物模型與人類疾病機(jī)理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所,云南 昆明650223;

2.中國(guó)科學(xué)院研究生院,北京100049)

樹鼩由于與靈長(zhǎng)類動(dòng)物有較密切的親緣關(guān)系和其個(gè)體小，以及繁殖周期短等特性而倍受關(guān)注, 尤其是作為醫(yī)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的研究，近年來(lái)已受到越來(lái)越多的重視, 但樹鼩的分類地位還一直有所爭(zhēng)論。該研究從樹鼩腦cDNA文庫(kù)中克隆得到編碼樹鼩神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y, NPY)前體序列, 序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)該序列與靈長(zhǎng)類NPY序列同源性高達(dá)96.9%。將該序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中其他物種的NPY序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹, 發(fā)現(xiàn)樹鼩與靈長(zhǎng)類處于同一分支。該研究結(jié)果揭示了樹鼩與靈長(zhǎng)類較近的親緣關(guān)系。

神經(jīng)肽Y; 樹鼩; 靈長(zhǎng)類

(1. Key Laboratory of Animal Models and Human Diseases Mechanisms of the Chinese Academy of Sciences and Yunnan Province, Kunming Institute of Zoology, the Chinese Academy of Sciences, Kunming 650223, China; 2. Graduate University of the Chinese Academy Sciences, Beijing 100049, China)

神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y, NPY)是Tatemoto et al (1982)首次從豬腦中提取純化出的一種具有生物活性的內(nèi)源性信息物質(zhì), 由36個(gè)氨基酸組成, 相對(duì)分子質(zhì)量為4.2×103。在結(jié)構(gòu)和功能上與胰多肽(avian pancreatic polypeptide, APP)和肽YY(peptide YY, PYY)非常相似, 所以將其劃分為胰多肽家族(Tatemoto et al,1982)。NPY序列N端和C端各有一個(gè)酪氨酸殘基, C端酪氨酸殘基存在酰胺化修飾(Allen et al,1987), 這與生物體內(nèi)許多活性肽(如促性腺激素GnRH)相同(Cerdá-Reverter & Larhammar, 2000)。這一修飾不僅可保護(hù)C端免受羧肽酶降解,同時(shí)與生物活性密切相關(guān)。N端的酪氨酸殘基對(duì)于NPY三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定及與NPY受體的結(jié)合非常重要(Tatemoto et al,1982)。

在細(xì)胞內(nèi), NPY以前體方式合成, 前體由97～98個(gè)氨基酸組成, N端28～29個(gè)氨基酸為信號(hào)肽,前體翻譯后經(jīng)過(guò)酶切、C端酪氨酸?；揎椇蟪蔀榫哂猩锘钚缘?6個(gè)氨基酸組成的活性肽(Higuchi et al,1988)。NPY在進(jìn)化過(guò)程中高度保守,哺乳動(dòng)物中, 人以及大鼠、豚鼠的成熟NPY氨基酸序列完全相同, 而豬的NPY也只是在第17位氨基酸有所不同，魚類電鰩目黑斑電鰩(Torpedo marmorata)有33個(gè)氨基酸與哺乳動(dòng)物NPY序列中一致，只有另外3個(gè)不同(Pedrazzini et al，2003)。

NPY最初從哺乳動(dòng)物中分離得到, 之后的研究發(fā)現(xiàn), NPY不僅在哺乳動(dòng)物中表達(dá), 也廣泛分布于鳥類、魚類和兩棲類。在體內(nèi), 神經(jīng)肽作為一種神經(jīng)遞質(zhì)參與體內(nèi)多種生理調(diào)節(jié)過(guò)程。NPY可直接對(duì)下丘腦活動(dòng)產(chǎn)生作用, 影響多種因子與激素的合成和分泌(Danger et al,1990; Breton et al,1991); NPY可促進(jìn)機(jī)體的攝食行為, 調(diào)節(jié)機(jī)體能量平衡(Kuo et al, 2007); 調(diào)節(jié)血管收縮, 具有增強(qiáng)血管緊張素II(AngII)、內(nèi)皮素和交感縮血管物質(zhì)(NE)等血管收縮物質(zhì)而抑制舒血管物質(zhì)的作用, 并且與免疫功能也有著密切關(guān)系(Zukowska et al, 2003)。除成熟肽以外, 前體加工過(guò)程中C端切割產(chǎn)生的30個(gè)氨基酸組成的肽段(CPON)也非常保守。有研究表明, CPON廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中,并且與NPY在神經(jīng)細(xì)胞中有相同的定位(Gulbenkian et al,1985; Marti et al,1990)。這似乎表明，CPON并不僅僅是NPY加工過(guò)程中的一個(gè)“副產(chǎn)物”, 它可能還發(fā)揮著其他的生物學(xué)功能, 遺憾的是, 目前仍沒(méi)有發(fā)現(xiàn)該肽段的生物學(xué)功能。

樹鼩是一種小型哺乳動(dòng)物, 由于與靈長(zhǎng)類相近,近年來(lái)受到越來(lái)越多科學(xué)工作者的關(guān)注。該文采用樹鼩腦組織為材料, 構(gòu)建cDNA文庫(kù), 以PCR方法擴(kuò)增得到一條編碼樹鼩NPY前體的cDNA序列。

1 材料與方法

1.1 樹鼩腦cDNA文庫(kù)的構(gòu)建

取成年樹鼩(Tupaia belangeri, 來(lái)自昆明動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心) 1只，麻醉劑麻醉后, 解剖頭部取出整個(gè)腦組織, 立即放入液氮中保存?zhèn)溆??？俁NA提取采用Trizol試劑(invitrogen), 參照試劑說(shuō)明書進(jìn)行。cDNA雙鏈合成采用CLONTECH公司SMARTTMcDNA Library Construction Kit試劑盒。一鏈?zhǔn)褂肅DSIII引物5'-ATTCTAGAGGCCG AGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3' (N=A、G、C、T; N-1=A、G、C)和SmartV寡聚核苷酸5'-AAGCA GTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3'合成；二鏈?zhǔn)褂?'PCR引物5'-AAGCAGTGGTATCAACG CAGAGT-3'合成。

1.2 克隆篩選

對(duì)上一步構(gòu)建的cDNA文庫(kù)進(jìn)行隨機(jī)克隆篩選, 根據(jù)構(gòu)建cDNA文庫(kù)時(shí)5'端和3'端通用序列設(shè)計(jì)引物, 上游引物和下游引物分別為：5'-AAGCAGTGGTATC-AACGCAGAGT-3'和5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-3', 引物由上海生物工程有限公司合成。以上一步smart合成雙鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR。反應(yīng)條件如下：首先95 °C變性5 min；接下來(lái)95 °C變性30 s, 55 °C退火30 s, 72 °C延伸1 min, 30個(gè)循環(huán)；最后72 °C延伸10 min。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 切膠回收, 克隆到PMD19-T載體(TaKaRa公司), 選擇103個(gè)陽(yáng)性克隆測(cè)序。

1.3 克隆序列與其他物種神經(jīng)肽Y前體序列比對(duì)

克隆得到的序列, 采用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI, National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站的BLAST 軟件, 將測(cè)序后獲得的cDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的序列進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.4 樹鼩神經(jīng)肽Y前體序列分子進(jìn)化分析

根據(jù)BLAST比對(duì)結(jié)果, 從GenBank中下載其他物種神經(jīng)肽Y前體序列, 采用MEGA5.0軟件(Tamura et al, 2011)鄰近歸并法(neighbor joining method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié) 果

2.1 樹鼩腦cDNA文庫(kù)構(gòu)建

提取的RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 結(jié)果顯示RNA濃度為882 ng/μL, OD260/OD280值為2.01, RIN值為8.28S/18S值1.7,各指標(biāo)均符合后續(xù)建庫(kù)要求。以所提RNA按照SMARTTMcDNA Library Construction Kit試劑盒操作手冊(cè)建立cDNA文庫(kù), 電泳檢測(cè)顯示250～2 000 bp位置有連續(xù)彌散狀, 符合說(shuō)明書要求, 可作為模板進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 樹鼩NPY序列克隆及序列比對(duì)

圖1 樹鼩腦組織cDNA文庫(kù)中克隆所得NPY核苷酸序列及對(duì)應(yīng)氨基酸序列Fig.1 The nucleotide sequence encoding neuropeptide Y (NPY) and corresponding amino acid sequence from Tupaia belangeri

將PCR擴(kuò)增所得序列測(cè)序, 得到一條長(zhǎng)度為291 bp的核苷酸序列, 其核苷酸序列如圖1所示。經(jīng)Blast比對(duì), 此片段與數(shù)據(jù)庫(kù)中人類NPY前體序列非常類似, 推測(cè)該序列編碼蛋白為樹鼩中NPY前體。291 bp為樹鼩NPY前體序列編碼區(qū), 可編碼97個(gè)氨基酸組成的NPY前體。其中前84 bp核苷酸序列編碼28個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽, 中間108 bp核苷酸編碼長(zhǎng)度為36個(gè)氨基酸的成熟肽。

2.3 樹鼩NPY前體序列與其靈長(zhǎng)類類似物同源性比較

將克隆得到樹鼩NPY前體序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)靈長(zhǎng)類中獼猴(Macaca mulatta登錄號(hào)NP_001027986.1)、人(Homo sapiens登錄號(hào)AAA59944.1)NPY前體序列進(jìn)行同源性比對(duì)。結(jié)果顯示，樹鼩NPY前體序列成熟肽36個(gè)氨基酸與靈長(zhǎng)類3個(gè)物種完全一致, 信號(hào)肽部分28個(gè)氨基酸也僅在第3、6、26位存在3個(gè)氨基酸的差異, 整個(gè)前體肽序列97個(gè)氨基酸中有94個(gè)氨基酸完全一致,同源性高達(dá)96.9%。

圖2 樹鼩NPY前體序列與其靈長(zhǎng)類類似物序列比對(duì)Fig.2 Comparison of Tupaia belangeri NPY precursor with Primates NPY precursors

2.4 樹鼩神經(jīng)肽Y前體序列分子進(jìn)化分析

將克隆所得樹鼩NPY前體與人(Homo sapiens, GenBank登錄號(hào)AAA59944.1)、獼猴(Macaca mulatta, NP_001027986.1)、褐家鼠(Rattus norvegicus, NP_036746.1)、小家鼠(Musmusculus, NP_075945.1)、紅原雞(Gallus gallus, NP_990804.1)、家鴿(Columba livia, ACB86930.1)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis, AAA49914.1)、熱帶爪蟾(Xenopus tropicalis, AAI35388.1)、七鰓鰻(Lampetra fluviatilis, AAA21352.1)、金魚(Carassius auratus, P28672.1)、錦鯉(Cyprinus carpio, Q9DGK7.1)、黃牛(Bos taurus, AAR37328.1)、白頰長(zhǎng)臂猿(Nomascus leucogenys, XP_003270460.1)、綿羊(Ovis aries, CAD10677.1) NPY前體序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹, 從圖3可以看出, NPY雖然在進(jìn)化過(guò)程中序列高度保守, 但也存在種屬特異性。樹鼩與靈長(zhǎng)類處于同一分支, 說(shuō)明兩者親緣關(guān)系較近。

圖3 神經(jīng)肽Y(NPY)氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Evolutionary tree of Neuropeptide Y amino acid sequence

3 討 論

NPY在生物體中分布廣泛, 目前通過(guò)分離純化和克隆手段已經(jīng)在多個(gè)物種中發(fā)現(xiàn)其類似物的存在, 包括脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物(Blomqvist et al, 1992)。通過(guò)不同物種間的序列比對(duì)發(fā)現(xiàn), NPY序列高度保守, 特別是發(fā)揮生物學(xué)活性的成熟肽序列部分。本研究從樹鼩腦組織cDNA文庫(kù)中克隆得到了一條相似的序列, 推測(cè)該序列在樹鼩體內(nèi)發(fā)揮著和其他物種類似的生物學(xué)功能。

長(zhǎng)久以來(lái), 樹鼩的系統(tǒng)分類地位一直存在爭(zhēng)議,有人主張將其歸入食蟲目, 有人認(rèn)為應(yīng)該屬于靈長(zhǎng)目, 后來(lái)又有人提出它們既不屬于靈長(zhǎng)目, 也不屬于食蟲目, 而是一個(gè)獨(dú)立的目, 稱為攀鼩目(Chen et al, 2011; Peng et al, 1991)。本研究通過(guò)克隆所得的樹鼩NPY前體序列與靈長(zhǎng)類類似物進(jìn)行同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn), 樹鼩NPY成熟肽序列與其他靈長(zhǎng)類完全吻合, 信號(hào)肽序列也僅存在3個(gè)氨基酸的差異. 但同時(shí)將靈長(zhǎng)類NPY前體序列與其他物種進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn), NPY成熟肽高度保守, 所以單從成熟肽序列不能判斷樹鼩與靈長(zhǎng)類之間親緣關(guān)系。不過(guò)雖然各物種間NPY成熟肽序列高度保守, 但信號(hào)肽部分保守程度卻較低, 存在種屬特異性, 因此，本研究選用NPY前體序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹來(lái)進(jìn)行研究。從構(gòu)建的進(jìn)化樹(圖3)可以看出, 該樹準(zhǔn)確定位了魚類、兩棲類、鳥類和哺乳類的親緣關(guān)系, 說(shuō)明以NPY前體序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹具有較高的可信度。從該進(jìn)化樹還可以看出, 樹鼩與靈長(zhǎng)類親緣關(guān)系更近,說(shuō)明樹鼩與靈長(zhǎng)類更相似。

Allen J, Novotny J, Martin J, Heinrich G. 1987. Molecular structure of mammalian neuropeptide Y: analysis by molecular cloning and computer-aided comparison with crystal structure of avian homologue[J]. Proc Natl Acad Sci USA,84(8): 2532-2536.

Blomqvist AG, S?derberg C, Lundell I, Milner RJ, Larhammar D. 1992. Strong evolutionary conservation of neuropeptide Y: sequences of chicken, goldfish, and Torpedo marmorata DNA clones[J]. Proc Natl Acad Sci USA,89(6): 2350-2354.

Breton B, Mikolajczyk T, Popek W, Bieniarz K, Epler P. 1991. Neuropeptide Y stimulates in vivo gonadotropin secretion in teleost fish[J]. Gen Comp Endocrinol,84(2): 277-283.

Cerdá-Reverter JM, Larhammar D. 2000. cNeuropeptide Y family of peptides: structure, anatomical expression, function, and molecular evolution[J]. Biochem Cell Biol,78(3): 371-392.

Chen SY, Xu L, Lü LB, Yao YG. 2011. Genetic diversity and matrilineal structure in Chinese tree shrews inhabiting Kunming, China[J]. Zool Res,32(1): 17-23. [陳仕毅,許凌,呂龍寶,姚永剛. 2011.昆明城郊中國(guó)樹鼩群體線粒體DNA遺傳多樣性[J].動(dòng)物學(xué)研究,32(1): 17-23.]

Danger JM, Tonon MC, Jenks BG, Saint-Pierre S, Martel JC, Fasolo A, Breton B, Quirion R, Pelletier G, Vaudry H. 1990. Neuropeptide Y: localization in the central nervous system and neuroendocrine functions[J]. Fundam Clin Pharmacol,4(3): 307-340.

Gulbenkian S, Wharton J, Hacker GW, Varndell IM, Bloom SR, Polak JM. 1985. Co-localization of neuropeptide tyrosine (NPY) and its C-terminal flanking peptide (C-PON)[J]. Peptides,6(6): 1237-1243.

Higuchi H, Yang HY, Sabol SL. 1988. Rat neuropeptide Y precursor geneexpression. mRNA structure, tissue distribution, and regulation by glucocorticoids, cyclic AMP, and phorbol ester[J]. J Biol Chem,263(13): 6288-6295.

Kuo L E, Kitlinska JB, Tilan JU, Li L, Baker, SB, Johnson MD, Lee EW, Burnett MS, Fricke ST, Kvetnansky R, Herzog H, Zukowska Z. 2007. Neuropeptide Y acts directly in the periphery on fat tissue and mediates stress-induced obesity and metabolic syndrome[J]. Nat Med,13(7): 803-811.

Marti E, Bello AR, Lancha A, Batista MA. 1990. Neuropeptide tyrosine (NPY) and its C-terminal flanking peptide (C-PON) in the developing and adult spinal cord of a reptile[J]. J Anat,172: 149-156.

Pedrazzini T, Pralong F, Grouzmann E. 2003. Neuropeptide Y: the universal soldier[J]. Cell Mol Life Sci,60(2): 350-377.

Peng YZ, Ye ZZ, Zou RJ, Wang YX, Tian BP, Ma YY, Shi LM. 1991. Biology of Chinese Tree Shrew[M]. Kunming, China: Yunnan Science and Technology Press. [彭燕章,葉智彰,鄒如金,王應(yīng)祥,田保平,馬原野,施立明. 1991.樹鼩生物學(xué).昆明:云南科技出版社.]

Tatemoto K, Carlquist M, Mutt V. 1982. Neuropeptide Y--a novel brain peptide with structural similarities to peptide YY and pancreatic polypeptide[J]. Nature,296(5858): 659-660.

Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S. 2011. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods[J]. Mol Biol Evol,28(10): 2731-2739.

Zukowska Z, Pons J, Lee EW, Li LJ. 2003. Neuropeptide Y: a new mediator linking sympathetic nerves, blood vessels and immune system?[J]. Can J Physiol Pharmacol,81(2): 89-94.

Molecular cloning ofTupaia belangeri chinensisneuropeptide Y and homology comparison with other analogues from primates

DONG Li1,2，Lü Long-Bao1, LAI Ren1,*

Much attention has been payed to tree shrews for their close phylogenetic relationship with primates, small size, and short reproductive cycle. Especially, they are considered as excellent experiential animals for medicine or/and disease research. A nucleotide sequence encoding neuropeptide Y(NPY) precursor has been cloned from the cDNA library ofTupaia belangeri chinensis. Sequence alignment revealed that the sequence homology with primate NPY was up to 96.9%. The phylogenetic analysis based on NPY precursor sequence revealed that the tree shrew has a close relationship with primates.

Neuropeptide Y;Tupaia belangeri chinensis; Primates

Q959.832; Q951.3; Q347

A

0254-5853-(2012)01-0075-04

10.3724/SP.J.1141.2012.01075

2011-10-31；接受日期：2011-12-29

中國(guó)科學(xué)院基礎(chǔ)前沿研究專項(xiàng)項(xiàng)目(KSCX2-EW-R-11, KSCX2-EW-J-23);中國(guó)科學(xué)院和云南省動(dòng)物模型與人類疾病機(jī)理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目

?通信作者(Corresponding author)，E-mail: rlai@mail.kiz.ac.cn