劉寶全，王劍鋒，李春斌，范圣第

(大連民族學(xué)院生物化學(xué)工程－國(guó)家民委－教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116605)

蛋白質(zhì)“酶解度”概念的探究

劉寶全，王劍鋒，李春斌，范圣第

(大連民族學(xué)院生物化學(xué)工程－國(guó)家民委－教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116605)

分析了蛋白質(zhì)水解度參數(shù)在監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)酶解過(guò)程中的不足，并根據(jù)蛋白質(zhì)酶解過(guò)程特點(diǎn)提出了酶解度的概念與測(cè)定方法。將酶解度定義為一個(gè)比值，用于描述蛋白質(zhì)酶解體系中新增肽鏈數(shù)相對(duì)于原有肽鏈數(shù)的變化，可以有效反映酶對(duì)蛋白質(zhì)的酶切過(guò)程。根據(jù)酶解度的定義，只要分別測(cè)定出酶解前的體系中肽鏈數(shù)目與酶解后體系中的肽鏈增量，通過(guò)計(jì)算兩者的比值就可以計(jì)算出該條件下的酶解度。體系中的肽鏈數(shù)目可以通過(guò)甲醛滴定法測(cè)定出體系中的游離氨基數(shù)與新增游離氨基數(shù)來(lái)計(jì)算。

酶解度(DEH);蛋白質(zhì);酶;水解

蛋白質(zhì)可以在酸(或堿)的作用下水解形成氨基酸，用于氨基酸制備或蛋白質(zhì)的組成氨基酸鑒定分析。在利用酸(或堿)水解蛋白質(zhì)進(jìn)行氨基酸工業(yè)生產(chǎn)的過(guò)程中，為監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)的水解程度，提出了蛋白質(zhì)水解度(Degree of hydrolysis，DH)的概念［1－2］。水解度通常用蛋白質(zhì)全部肽鍵被水解的百分比表示，即已經(jīng)水解的肽鍵占蛋白質(zhì)水解前肽鍵總數(shù)的百分比［1－2］。本文作者在從事蛋白質(zhì)酶解過(guò)程研究中發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)行未知蛋白質(zhì)(尤其是少數(shù)民族地區(qū)的特色資源中的蛋白質(zhì)組分)的酶解實(shí)驗(yàn)時(shí)，根本無(wú)法找到相關(guān)的數(shù)據(jù)用于計(jì)算體系中的蛋白質(zhì)底物的肽鍵數(shù)目，利用蛋白質(zhì)水解度不能很好地開(kāi)展未知蛋白質(zhì)的酶解進(jìn)程，由此特別提出了蛋白質(zhì)的酶解度概念，從而為蛋白質(zhì)酶解過(guò)程分析提供一種新的更有效的方法打下基礎(chǔ)。

1 利用水解度監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)酶解過(guò)程的不足

蛋白質(zhì)的酸(或堿)水解與蛋白質(zhì)酶解的最大區(qū)別在于，酸(或堿)水解對(duì)氨基酸序列沒(méi)有選擇性，而酶(特別是內(nèi)切酶)酶解對(duì)蛋白質(zhì)的氨基酸序列有選擇性，只能在特定的位置上進(jìn)行氨基酸鏈的切割。為了便于計(jì)算，以一個(gè)由1 001個(gè)氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)為例，在進(jìn)行酸堿水解時(shí)，酸(或堿)可以在任一位置斷裂肽鍵，最后得到構(gòu)成該蛋白的各種氨基酸;每水解一個(gè)肽鍵，其水解度就增加0.1%，最后達(dá)到100%。

蛋白質(zhì)的酶解與酸(或堿)水解不同，酶對(duì)蛋白質(zhì)底物有氨基酸排列順序的要求。構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸有20種，如果隨機(jī)排列，某一個(gè)特異的三氨基酸排列出現(xiàn)的機(jī)率只有1/8 000。假設(shè)上述由1 001個(gè)氨基酸組成的蛋白中有100個(gè)某個(gè)特異性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)(這在真實(shí)蛋白中是不可能的);用這種酶對(duì)該蛋白質(zhì)進(jìn)行水解時(shí)，最終的水解度最大值也僅有10%，還有90%的肽鍵未被水解。對(duì)底物序列有高度選擇性的Xa因子(識(shí)別與切割序列為:－Ile－Glu－Gly－Arg↓X)，在重組蛋白中只有一個(gè)人為添加的識(shí)別與切割位點(diǎn)，如果也是對(duì)一個(gè)由1 001個(gè)氨基酸組成的重組蛋白進(jìn)行切割，水解度最高也只有0.1%;當(dāng)研究酶解動(dòng)力學(xué)時(shí)，各種因素對(duì)水解度的影響必定都在0.1%以內(nèi);如果底物蛋白質(zhì)中肽鍵的一半都被酶解時(shí)，其水解度也僅為0.05%。

用水解度研究蛋白質(zhì)的酶解過(guò)程，不僅因水解度非常低而造成表述問(wèn)題，還有一個(gè)關(guān)鍵的制約因素，那就是:如果要計(jì)算蛋白質(zhì)水解度，就一定要先測(cè)定出蛋白質(zhì)中的肽鍵總數(shù)(即組成氨基酸數(shù)目)。這對(duì)于全部序列已知的重組蛋白來(lái)說(shuō)較為容易，對(duì)于從生物體分離出來(lái)的非重組蛋白則較為困難，大多數(shù)天然蛋白質(zhì)都不知道其準(zhǔn)確的氨基酸組成，一般都要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子量分析與氨基酸組成分析，才能知道其準(zhǔn)確的肽鍵數(shù)目。所以要測(cè)未知蛋白的酶解，一般只做分子量分析，再根據(jù)氨基酸的平均分子量，估算蛋白的氨基酸組成數(shù)目，進(jìn)而計(jì)算蛋白質(zhì)的水解度。此時(shí)計(jì)算出的水解度不能是一個(gè)精確的數(shù)據(jù)。

針對(duì)利用水解度研究蛋白質(zhì)酶解過(guò)程中存在的數(shù)值低、計(jì)算肽鍵總數(shù)困難的兩點(diǎn)不足，我們提出了蛋白質(zhì)的酶解度概念。

2 蛋白質(zhì)酶解度的定義

蛋白質(zhì)是由氨基酸通過(guò)肽鍵依次連接構(gòu)成的線性結(jié)構(gòu)，一端是游離的氨基，另一端為游離的羧基。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)發(fā)生酶解時(shí)，蛋白質(zhì)中的一個(gè)肽鍵被水解，就形成一個(gè)新的游離氨基與一個(gè)新的游離羧基;同時(shí)多肽鏈由一條變?yōu)閮蓷l，每一條新肽鏈都有一個(gè)原來(lái)的游離氨基(或羧基)和一個(gè)新形成的游離羧基(或氨基)。所以可以利用游離的氨基(或羧基)來(lái)監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)的酶解進(jìn)程，并依此定義蛋白質(zhì)的酶解度(Degree of enzymatic hydrolysis，DEH)。蛋白質(zhì)酶解度(DEH)是指酶解體系中新增肽鏈總數(shù)與酶解前肽鏈總數(shù)的比值。

式中，AN表示體系中的游離氨基總數(shù)，A取自英文單詞amount，N代表蛋白質(zhì)氨基末端，下角標(biāo)0表示反應(yīng)起始階段，下角標(biāo)1表示酶解反應(yīng)進(jìn)程中第一次取樣測(cè)定結(jié)果。同理，也可以用AC代表體系中的游離羧基總數(shù)，DEH的計(jì)算公式更替為

由于蛋白質(zhì)酶解時(shí)，要向體系中添加蛋白酶;而蛋白酶本身也有游離氨基與游離羧基，在測(cè)定酶解進(jìn)程時(shí)，要將體系中蛋白酶的游離氨基(或羧基)扣除，所以計(jì)算公式修正為

式中，ANE和ACE分別代表體系中添加的蛋白酶的游離氨基和游離羧基數(shù)目。

為簡(jiǎn)化計(jì)算，僅以一條蛋白質(zhì)多肽鏈進(jìn)行酶解分析。當(dāng)一條多肽鏈進(jìn)行酶解時(shí)，發(fā)生一次酶解，其酶解度DEH通過(guò)式(3)或式(4)計(jì)算可知，DEH值為1;2次酶解時(shí)，DEH值為2;3次酶解時(shí)，DEH值為3。從以上結(jié)果可知，利用蛋白質(zhì)酶解度能非常好地體現(xiàn)酶解進(jìn)程。

在實(shí)際計(jì)算過(guò)程中，式(3)與式(4)可以變形為

在計(jì)算公式中，ANE、AN0、ACE、AC0均在反應(yīng)前進(jìn)行測(cè)定，在酶過(guò)程中是常數(shù)，反應(yīng)進(jìn)程監(jiān)測(cè)主要是測(cè)定AN1或AC1。當(dāng)酶的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于蛋白質(zhì)底物濃度時(shí)，ANE/AN0和ACE/AC0可以忽略不計(jì)，蛋白質(zhì)的酶解度計(jì)算公式簡(jiǎn)化為

根據(jù)簡(jiǎn)化式(7)和式(8)，只要測(cè)出酶解后體系中的多肽鏈數(shù)目與反應(yīng)前的多肽鏈數(shù)目比，就可以非常簡(jiǎn)便地算出酶解度。這在利用分光光度法測(cè)定中非常有用，只要在測(cè)定體系的線性范圍內(nèi)，可以直接利用光吸收值進(jìn)行DEH值計(jì)算，使反應(yīng)監(jiān)測(cè)更易于進(jìn)行。

3 蛋白質(zhì)酶解度的甲醛滴定法測(cè)定

進(jìn)行蛋白質(zhì)酶解度測(cè)定，不需要將樣品完全水解，只要能有效測(cè)定反應(yīng)體系中的多肽鏈數(shù)目變化，就可以計(jì)算蛋白質(zhì)的酶解度。確定反應(yīng)體系中的多肽鏈數(shù)目，最重要的方法是測(cè)定體系中的游離氨基數(shù)目。在蛋白質(zhì)水解度測(cè)定的相關(guān)方法［1］中，只要能有效測(cè)定反應(yīng)體系中氨基或羧基數(shù)目，都可以用于蛋白質(zhì)酶解度的測(cè)定。下面重點(diǎn)介紹簡(jiǎn)便易行的甲醛滴定法。

甲醛滴定法［2－3］的基本原理是利用甲醛與多肽鏈中的游離氨基結(jié)合形成羥甲基衍生物，使原來(lái)與氨基結(jié)合的氫離子解離出來(lái)，再用標(biāo)定的堿進(jìn)行滴定，新消耗的標(biāo)定堿的摩爾數(shù)就是體系中新增加游離氨基的摩爾數(shù)。一般選用酚酞做滴定指示劑，分別測(cè)定添加甲醛前后滴定到酚酞變色時(shí)的標(biāo)定堿的用量，即可計(jì)算出體系中因加入甲醛而釋放的氫離子摩爾數(shù)，從而計(jì)算出體系中新增的游離氨基數(shù)目。具體的操作方法將在下期的“甲醛滴定法測(cè)定牛血清白蛋白的酶解度”論文中詳細(xì)論述。

雖然蛋白質(zhì)側(cè)鏈中的游離氨基會(huì)造成測(cè)定的初始多肽鏈數(shù)目偏高，但是在根據(jù)式(3)計(jì)算新增加游離氨基數(shù)目時(shí)，蛋白質(zhì)側(cè)鏈中的游離氨基對(duì)測(cè)量結(jié)果的干擾可以通過(guò)2次測(cè)定值相減(AN1－AN0－ANE)而有效消除。利用甲醛滴定法可以較為準(zhǔn)確地計(jì)算出反應(yīng)前后體系中的游離氨基的數(shù)目變化，進(jìn)而通過(guò)計(jì)算酶解度來(lái)監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)的酶解進(jìn)程。

［1］徐英操，劉春紅.蛋白質(zhì)水解度的測(cè)定方法綜述［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2007，28(7):173 －176.

［2］徐勤，葛向陽(yáng)，劉建峰.甲醛法測(cè)大豆蛋白水解度的改進(jìn)［J］.飼料工業(yè)，2008，29(5):46－47.

［3］張龍翔，張庭芳，李令媛.生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)［M］.北京:高等教育出版社，1997.

Exploration of Conception of Degree of Enzymatic Hydrolysis

LIU Bao－quan，WANG Jian－feng，LI Chun－bin，F(xiàn)AN Sheng－di
(Key Laboratory of Biochemistry Engineering of the State Ethnic Affairs Commission－Ministry of Education，
School of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian Liaoning 116605，China)

The major defects of DH(degree of hydrolysis)were discussed，and the conception and determination methods of DEH(degree of enzymatic hydrolysis)were developed in this article.The DEH was defined as a ratio between the addition of peptide chains and the amounts of origin peptide chains of the protein in enzymatic system to determine the degree of enzymatic hydrolysis of protein.When the amounts and addation of peptide chains were determined and calculated，the value of DEH would obtained according to the conception of DEH.The amounts of free amino groups，determined by formol titration，could be used to calculate the value of DEH.Key words:degree of enzymatic hydrolysis;protein;enzyme;hydrolysis

Q519

A

1009－315X(2012)01－0009－03

2011－10－27

教育部科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(2010－263);國(guó)家民委項(xiàng)目(09DL08);遼寧省教育廳資助項(xiàng)目(2009A154);大連民族學(xué)院引進(jìn)人才啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(20096102)。

劉寶全(1972－)，男，蒙古族，遼寧北票人，講師，博士，主要從事化學(xué)與生物學(xué)交叉學(xué)科研究。

(責(zé)任編輯 鄒永紅)