王湘南 ，陳永忠 ，王 瑞 ，朱朝陽 ，彭邵鋒 ，陳隆升，馬 力

油茶花粉活力及柱頭可授性研究

王湘南1，陳永忠1，王 瑞1，朱朝陽2，彭邵鋒1，陳隆升1，馬 力1

（1.湖南省林業(yè)科學院, 湖南 長沙 410004；2.中南林業(yè)科技大學， 湖南 長沙 410004）

用TTC法測定油茶花粉散粉后的活力變化及壽命，用瓊脂培養(yǎng)基萌發(fā)法測定了花粉萌發(fā)率，用聯(lián)苯胺－過氧化氫法測定了柱頭可授性。結果表明：油茶花粉活力在散粉8 h呈上升趨勢，即散粉第1～2 天保持較高活力，隨后活力開始下降，花粉壽命為4～10 d，最佳傳粉期為開花后第1～5 天；油茶花粉萌發(fā)率是體現(xiàn)花粉活力的一個指標，結果略低于TTC法測定的花粉活力值，它是對TTC法測定花粉活力的補充和驗證；油茶柱頭可授性持續(xù)3～6 d，花苞在將開而未開時已具備一定可授性，開花第1～5天柱頭可授性呈上升趨勢，第5～10天可授性減弱至基本消失；與柱頭可授性相比，花粉壽命相對長些，試驗結果與所觀測的單花開放壽命較相一致。

油茶；散粉；花粉活力；萌發(fā)率；柱頭可授性

油茶Camellia oleifera 屬山茶科山茶屬，灌木或喬木[1-2]，主產(chǎn)我國，廣泛分布于我國長江流域以南的l8個省(自治區(qū))[3-4]，是我國南方主要食用油料樹種，也是世界四大木本食用油料樹種之一[5]，其種子榨得的油色清味香，油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸含量占90%左右，脂肪酸組成合理，營養(yǎng)豐富[3-4，6-9]，是一種優(yōu)質(zhì)保健的食用油。其茶籽粕和果殼含有茶皂素、糖類、粗蛋白、粗纖維等，可制成皂素、活性炭、糠醛、烤膠、飼料、肥料等多種化工產(chǎn)品[10-14]，是很好的化工、醫(yī)藥等原料，開發(fā)價值和潛力大。

花粉保持活力時間的長短和柱頭可授期的長短結合在一起，嚴重影響著異花傳粉植物的傳粉成功率[15]。油茶花粉活力及柱頭可授性有少量報道，如莊瑞林等[16]報道油茶花初開后花藥全部開裂，第1、2天采集的花粉萌發(fā)率高，生活力較強，柱頭具有受精能力的時間是開花后8～48 h；鄧園藝等[17]報道油茶花在開花8 h后，其花粉活力（活性花粉所占百分比）達到最大值，第2天開始緩慢下降，柱頭可授性在開花第2天達到最大，從第3天開始下降，第4天基本上沒有可授性；何漢杏等[18]報道油茶開花授粉時間2～3 d；其它暫沒發(fā)現(xiàn)油茶相關詳細報道。

本研究對湖南油茶湘林系列、江西贛系列等無性系進行花粉活力和柱頭可授性研究，探索油茶種質(zhì)植物開花散粉后不同時間內(nèi)的花粉活力和柱頭可授粉性的變化規(guī)律，為提高其繁殖效率及其雜交育種和資源利用提供理論依據(jù)和參考資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗材料取自湖南省林科院試驗林場油茶種質(zhì)資源收集圃。資源收集圃位于長沙市南郊，地理位置東經(jīng) 113°1′，北緯 28°6′，海拔高度 80 ～100 m。土壤為第四紀酸性紅壤，土層厚度50～100 cm，有機質(zhì)含量1.57%，pH值4.8。氣候?qū)僦衼啛釒Ъ撅L氣候，四季分明，春濕多變，夏季高溫，夏秋常旱，全年無霜期約275 d，年平均氣溫16.8～17.2 ℃，年降水量1 422 mm。參試植株為大樹高接換冠，樹冠已完全恢復，平均樹高2.5 m，平均冠幅4.2 m2。參試品種為湖南種源湘林系列和江西種源贛系列無性系，品種編號分別為湘林系列馬1號、馬3號、DZ1號和贛系列贛6號?；ǚ刍盍Φ臏y定：每品種各選定生長正常植株3株，分單株、不同批次采集測定。柱頭可授性的測定：每品種選定多株生長正常、待開花苞多的植株。實驗時間為2010年11月～2011年1月和2011年10月～11月。

1.2 方 法

采用氯化三苯基四氮唑法(TTC法)和瓊脂培養(yǎng)基萌發(fā)法檢測花粉活力和萌發(fā)率，用聯(lián)苯胺-過氧化氫法測定柱頭可授性。

1.2.1 花粉活力檢測

利用0.5%TTC（氯化三苯基四氮唑）溶液使有生活力的花粉變成紅色，而喪失生活力或者敗育的花粉則不顯紅色來測定花粉生活力[19-21]。具體方法是：將成熟待開花苞采集回實驗室，待其完全散粉，取適量花粉于載玻片上，滴加1～2滴0.5%的TTC溶液涂抹均勻，蓋上蓋玻片，在保濕條件下于25℃恒溫箱中培養(yǎng)0.5～2 h后進行鏡檢。每個樣品做3個玻片重復，每玻片選取花粉粒分布均勻且數(shù)目不少于50粒的5個視野進行統(tǒng)計。結果計算公式為：R=(m1/m2)×100%。式中R為花粉生活力（%）；m1為視野中顯紅色或粉紅色花粉粒數(shù)；m2為該視野中總花粉粒數(shù)。

1.2.2 花粉萌發(fā)率檢測

參考何春燕等[20-26]篩選油茶花粉培養(yǎng)基萌發(fā)配方（1%瓊脂+10%蔗糖+0.01%硼酸）進行試驗。具體方法是：用玻璃棒蘸取適量加熱融化的培養(yǎng)基液滴于單凹載玻片上，取適量花粉均勻播撒于培養(yǎng)基液表面，置于25℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 h后在Olympus10×10倍顯微鏡下觀察花粉的萌發(fā)狀況，鏡檢計數(shù)。每樣品做5平行玻片，每玻片取3個視野，選取花粉粒數(shù)目不少于50粒且分布均勻的視野進行統(tǒng)計。計數(shù)以花粉管長度超過花粉粒直徑作為萌發(fā)標準，24 h后仍未萌發(fā)的花粉粒定為不會萌發(fā)的花粉。結果計算公式為：A=(x/y)*100%。式中A表示花粉萌發(fā)率(%)；x表示視野中已萌發(fā)花粉數(shù)；y表示視野中花粉?？倲?shù)。

1.2.3 柱頭可授性檢測

用聯(lián)苯胺-過氧化氫法測定柱頭可授性[27-30]。具體方法是：選擇進入初花期成熟花苞多的油茶大樹，于前一天下午選擇成熟待開花苞200～300朵做好標記，在實驗采樣階段每天8：00～17：00隨時跟蹤觀察標記的花苞開花的進程并做好記錄，于不同時間段每次采集樣品10～15朵，將其柱頭放人凹面載玻片中，滴加混合液（V聯(lián)苯胺∶V過氧化氫∶V水＝4∶11∶22)，蓋上蓋玻片，鏡下觀察，若柱頭周圍反應液呈現(xiàn)藍色并伴有大量氣泡出現(xiàn)，則表示柱頭具可授性，通過比較其氣泡量的多少和大小來衡量其可授性的強弱。測定開花當天柱頭可授性變化在花苞略微松動露縫、將開而未開階段開始至完全張開的8 h內(nèi)每隔0.5～1.5 h采樣，其它根據(jù)開花不同時間于每天上午11：30或下午16：30左右采樣，采樣測定到柱頭可授性消失為止。

2 結果與分析

2.1 花粉活力檢測結果

取散粉第2、4、6、8 h的花粉進行TTC法花粉活力測定，測定結果表明：油茶花粉在散粉8 h期間，其活力一直呈上升趨勢（見圖1、圖2），前4 h增幅較快，4 h后增幅趨緩，同品種不同植株間、同植株不同批次間采樣測得的結果略有差異（圖1、圖2中A、B代表不同批次采樣，數(shù)字代表不同株）。從圖1，2可看出，花粉在散粉8 h其活力已基本趨于最大，部分顯示仍具上升趨勢。從圖3、圖4可看出：花粉散粉1～3 d其活力都保持較高水平，花粉活力為84%～91%；散粉第5 天馬1號、馬3號花粉活力分別為75.1%、69.3%，第7天、10天分別為55.5%、48.0%和58.3%、40.8%，第13天為32.6%和25.7%。

2.2 瓊脂培養(yǎng)基花粉萌發(fā)實驗結果

采用優(yōu)化了的油茶花粉培養(yǎng)基進行花粉萌發(fā)實驗（見圖5），花粉管生長良好，馬1號、馬3號花粉萌發(fā)率與TTC法檢測的花粉活力較一致，萌發(fā)率略小于TTC法檢測的花粉活力值，兩者的檢測結果起到相互檢驗和修正作用。

圖1 馬1號離體水培散粉當天活力變化Fig.1 Pollen viability intraday varieties of Ma No.1 by water culture

圖2 馬3號離體水培散粉當天活力變化Fig.2 Pollen viability intraday varieties of Ma No.3 by water culture

圖3 馬1號花粉活力隨散粉天數(shù)變化Fig.3 Pollen viability varieties of Ma NO.1 in the following days

圖4 馬3號花粉活力隨散粉天數(shù)變化Fig.4 Pollen viability varieties of Ma No.3 in the following days

2.3 柱頭可授性檢測結果

從圖6可看到：油茶花在將開而未開時柱頭已具有過氧化物酶活性，即柱頭已具備一定可授性。花苞從未張開至露縫張開而未全開的3 h內(nèi)，柱頭過氧化物酶活性增長緩慢，略有增加，變化不大。開花3 h后，過氧化物酶活性開始明顯增強，在開花4 h時柱頭可授性達當天最高值，隨后緩慢下降，開花8 h時柱頭可授性活力降至開花3 h左右的水平。從圖7～10可看出：開花第1～5天柱頭可授性呈上升趨勢，隨后迅速下降，第7～8天柱頭可授性已較弱，第9～10天柱頭可授性減弱至基本消失。

圖5 馬1號、馬3號花粉培養(yǎng)基萌發(fā)Fig.5 Pollen germination in medium of varieties Ma No.1 and Ma NO.3

圖6 馬1號開花第1天（白晝）柱頭活力變化（花期11中～1月下旬）Fig.6 Chapiter viability variety of Ma NO.1 in first day

圖7 馬1號開花柱頭活力變化（花期11月中～1月下旬）Fig.7 Chapiter viability variety of Ma NO.1 in following days

圖8 馬3號開花柱頭活力變化（花期11月上～12月下旬）Fig.8 Chapiter viability variety of Ma NO.3 in following days

圖9 DZ1號開花柱頭活力變化（花期10月中～11月下旬）Fig.9 Chapiter viability variety of DZ No.1 in the following days

圖10 贛6號開花柱頭活力變化(花期10月上中～11月中旬)Fig.10 Chapiter viability variety of Gan No.6 in following days

3 結論與討論

（1）油茶花粉在開花散粉8 h期間其活力一直呈上升趨勢，并且有繼續(xù)上升的趨勢。油茶一天當中開花時間不超過8 h，一般于開花第1～3天散粉，散粉快慢視開花時天氣而定，晴、陰、下雨或溫度、濕度高低不同以及種質(zhì)不同在散粉快慢上都存在一定差異，有開花當天散粉完全和開花3 d仍不完全散粉的。一般冬季氣溫0～5℃或陰天時開花會推遲散粉或散粉不完全，花粉在戶外低溫下散粉1～3 d內(nèi)都可保持較高活力，花粉壽命長可達10 d左右，最佳傳粉期為開花后第1～5天。始花期11月上至中旬的較晚花品種其柱頭可授性持續(xù)5～6 d，始花期10月上至中旬較早花品種柱頭可授性持續(xù)3 d左右，不同種質(zhì)存在差異。花期較早的種質(zhì)花期和單花壽命相對要比花期較晚的要短。經(jīng)過2008～2011年連續(xù)野外觀察發(fā)現(xiàn)，江西種源種質(zhì)贛6花期在10～11月，單花壽命3～4 d，花期35～45 d；湖南種源種質(zhì)湘林馬1號花期在11～1月，單花壽命6～10 d，花期60～90 d。除了花期氣候?qū)ㄆ诤蛦位ㄩ_放壽命具有外在的影響外，花期不同的種質(zhì)在長期生境影響下逐漸形成各自物候生長特性，已具有種質(zhì)的遺傳特性，引種的種質(zhì)在不同的生境環(huán)境下會產(chǎn)生一定的適應性改變，不同地理種源種質(zhì)物候生長的遺傳特性對其有一定制約。

（2）柱頭可授性在開花第1天呈先上升后下降的曲線形變化。柱頭在花苞將開未開時已具有一定可授性，在花瓣開始張開的4 h上升至最高值，至5 h開始下降，開花7～8 h時柱頭可授性降至初開3 h左右時的大小。推測這一變化應該與其開花時間段的天氣光照變化以及植物內(nèi)在生物鐘的生長調(diào)節(jié)有關，與我們觀測的單花開放動態(tài)結果相符，是其植物生物學特性的表現(xiàn)。經(jīng)觀察，油茶花一般于上午8：00～9：30開始開花，早上氣溫越低則開放得愈遲，11：30～16：00開放程度最大，此時花器各器官生活力處于一天中最旺盛時期，柱頭可授性也最強，到了16：30～18：00，張開的花瓣會有所收攏閉合，至第2天上午8：00左右又重新開始張開，一般開花第1～3天會重復這一過程，因此早晚的柱頭可授性會隨之有所下降，即外界環(huán)境氣溫、光照對其產(chǎn)生一定日周期變化的影響。

（3）從現(xiàn)有文獻看，還沒發(fā)現(xiàn)柱頭可授性檢測中有一個具體可量化和很好地衡量柱頭可授性等級的方法。本實驗中根據(jù)柱頭周圍出現(xiàn)氣泡的快慢、大小和數(shù)量來比較劃分柱頭可授性的強弱等級，這一方法存在一定的人為因素誤差。為了準確劃分和盡量減少誤差，在實驗中分析柱頭檢測的時間，認為以檢測10～15 min時柱頭冒出氣泡的速度、大小和數(shù)量以及綜合觀察花柱外觀形態(tài)色澤的變化來判斷柱頭可授性的強弱比較科學，結合實驗觀察和戶外開花動態(tài)實物觀測，相互對照綜合得出結論會讓實驗結果更準確些。

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Pollen viability and chapiter receptivity of Camellia oleifera

WANG Xiang-nan1, CHEN Yong-zhong1, WANG Rui1, ZHU Chao-yang2, PENG Shao-feng1, CHEN Long-sheng1, MA Li1
(1.Hunan Academy of Forestry, Changsha 410004, Hunan, China;2.Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

TTC method was utilized to determine the vigor change and life-span of the Camellia oleifera pollen after anther dehiscence;with agar medium germination method, the pollen germination rate was determined; and with benzidine-hydrogen peroxide method,the stigma receptivity was measured.The results show that Camellia oleifera pollen vigor showed a rising trend in 8 hours after anther dehiscence, within 1～2 days the pollen maintained at a high vigor level, then gradually declined, the life-span of Camellia oleifer pollen was around 4～10 days or so, and the best pollination period was 1 to 5 days after flowering; The rate of Camellia oleifer pollen germination is an indicator of pollen vigor, the determining value was slightly lower than the result of the TTC method, which is a kind of supplement and verification to TTC method in determining the pollen vigor; The stigma receptivity maintained for 3～6 days or so, but the best pollination period was about 5 days, among open in the bud and the un-blossomed the flowers already have a certain receptivity, flowering the first 1～5 days the stigma receptivity was rising, 5～10 days started to reduce until to basically disappeared;Compared with the period of stigma receptivity to pollen, life-span was relatively longer, the test results and the observation of a single flower opening life was consistent.

Camellia oleifera; anther dehiscence; pollen vigor; pollen germination rate; chapiter receptivity

S794.4

A

1673-923X(2012)03-0017-06

2012-01-10

湖南省科技廳科技計劃重點項目“油茶優(yōu)良種質(zhì)資源遺傳背景數(shù)據(jù)庫建設與規(guī)?？旆奔夹g研究”（2010FJ2010）；中央財政林業(yè)科技推廣示范跨區(qū)域重點推廣示范項目“油茶雜交新品種及豐產(chǎn)栽培技術集成示范”（[2011]TK074號）；林業(yè)公益性行業(yè)科研專項“油茶兩系雜交種子園營建及高產(chǎn)培育技術研究”（200804044）

王湘南(1967—),女,湖南衡陽人,高級工程師,碩士,主要從事油茶育種栽培工作;E-mail：wangxiangnan04@yahoo.com.cn

[本文編校：謝榮秀]