姜孝芳 李 卉 劉 玲 王洪江 李秀梅 陳 艷 龐作良諶宏鳴 尹 娜 李 艷 沙亞哈提·別爾克哈之 李惠武

食管癌發(fā)病具有民族及地區(qū)差異性，新疆哈薩克族食管癌的發(fā)病率遠(yuǎn)高于同地區(qū)其他民族［1-2］。研究哈薩克族食管癌患者基因表達(dá)，對(duì)食管癌發(fā)病機(jī)制的闡明具有重要意義。富含亮氨酸重復(fù)序列免疫球蛋白樣蛋白1（Lrig1）是負(fù)調(diào)控表皮生長(zhǎng)因子（EGFR）的上游因子［3］，在大多數(shù)腫瘤組織中Lrig1表達(dá)缺失或減弱［4］，被認(rèn)為是評(píng)價(jià)預(yù)后的指標(biāo)［5］。本研究檢測(cè)48例哈薩克族食管癌患者組織中Lrig1與核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）及基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）基因的表達(dá)，探討Lrig1在哈薩克族食管癌患者中的表達(dá)意義及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

標(biāo)本來(lái)源于2008年1月至2009年6月新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸外科48例新疆哈薩克族食管鱗癌手術(shù)患者（包括癌組織及相距6 cm以上的遠(yuǎn)端正常組織），本研究已獲新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽知情同意書。其中男性33例，女性15例，年齡37～67歲，術(shù)前均未行放療和化療。Ⅰ期1例，Ⅱa期13例，Ⅱb期5例以及Ⅲ期29例；其中高、中分化41例，低分化7例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例。

1.2 方法

組織中總RNA提取，采用Trizol（Invitrogen公司，美國(guó)）法提取總RNA，然后進(jìn)行下一步RT-PCR。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳，以GAPDH為內(nèi)參基因，引物序列及退火溫度見表1。

采用Western blot進(jìn)行蛋白檢測(cè)，取100～150 mg組織加入10倍體積裂解液，裂解液為1 mM EDTA，1 mM EGTA，150 mM NaCl，5 mM Tris·HCl，1%NP-40，0.1%SDS，1 mM PMSF。上樣總蛋白為60 mg，10%SDS PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。一抗孵育：Lrig1、GAPDH購(gòu)自美國(guó)Santa Cruze公司，MMP-2購(gòu)自北京中杉金橋公司，NF-κB購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；二抗孵育；ECM顯色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。χ2及Phi檢驗(yàn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 Lrig1、NF-κB及MMP-2 mRNA在癌組織及遠(yuǎn)端正常組織的表達(dá)

Lrig1、NF-κB及MMP-2組織中的協(xié)同表達(dá)率為52.1%（25/48），高于正常組織29.2%（14/48），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.019，表2），Lrig1、NF-κB及MMP-2基因PCR電泳見圖1。

在Lrig1、NF-κB及MMP-2 mRNA協(xié)同表達(dá)的組織中檢測(cè)Lrig1、NF-κB及MMP-2蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示NF-κB與Lrig1蛋白表達(dá)具有相關(guān)性。Lrig1高表達(dá)的組織中，NF-κB表達(dá)弱（6N，7T），而在Lrig1弱表達(dá)或基本不表達(dá)的組織中NF-κB表達(dá)高（6T，7N）（圖2A）。在Lrig1高表達(dá)的組織中，MMP-2表達(dá)弱（9T，9N），而在Lrig1表達(dá)弱或基本不表達(dá)的組織中MMP-2表達(dá)高（10T，10N，11T）（圖2B）。提示Lrig1與NF-κB及MMP-2之間可能呈負(fù)相關(guān)，需要擴(kuò)大樣本進(jìn)一步驗(yàn)證。

表1 各基因引物Table1 Specific primer for genes

表2 哈薩克族食管癌患者Lrig1與MMP-2和NF-κB表達(dá)Table2 mRNA co-expression of Lrig1，NF-κB，and MMP2 in Hazak's ESCC

圖1 各基因2%瓊脂糖凝膠電泳圖Figure1 2%agarose gel electrophoresis pattern of the genes

2.2 Lrig1與PI3K信號(hào)通路及MEK-ERK信號(hào)通路的關(guān)系

檢測(cè)PI3K、AKT1、MEK1、MEK2、MEK5、ERK1 、ERK2基因mRNA在標(biāo)本中的陽(yáng)性率，分析以上各基因表達(dá)與Lrig1 mRNA的關(guān)系。結(jié)果顯示癌組織中MEK5、ERK2與Lrig1相關(guān)（P＜0.05），在遠(yuǎn)端正常組織中 PI3K 表達(dá)與 Lrig1相關(guān)（P＜0.001），其他基因MEK1、MEK2、ERK1、AKT1在癌組織及遠(yuǎn)端正常組織中與Lrig1不相關(guān)（P＞0.05），R為Phi相關(guān)系數(shù)（表3）。

圖2 Lrig1、NF-κB、MMP-2 10%PAGE電泳圖Figure2 PAGE gel electrophoresis patterns of Lrig1,NF-κB,and MMP-2

2.3 Lrig1、MMP-2及NF-κB mRNA的協(xié)同表達(dá)標(biāo)本與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

Lrig1、MMP-2及NF-κB mRNA協(xié)同表達(dá)的標(biāo)本中80%（20/25）發(fā)生了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而在非協(xié)同表達(dá)的標(biāo)本中只有47.8%（11/23）發(fā)生了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.020，表4），提示Lrig1、MMP2及NF-κB mRNA的協(xié)同表達(dá)促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

表3 哈薩克族食管癌患者組織中NF-κB、MMP-2、MEK1、MEK2、MEK5、ERK1、ERK2、PI3K、AKT1與Lrig1的相關(guān)性（n=48）Table3 Relationship of Lrig1 expression with NF-κB,MMP-2,MEK1,MEK2,MEK5,ERK1,ERK2,PI3K,and AKT1 in cancer tissues of Hazak's ESCC(n=48)

表4 Lrig1、NF-κB、MMP2 mRNA協(xié)同表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系Table4 Relationship of the co-expression of Lrig1,NF-κB,and MMP2 mRNA with clinicopathological indices

3 討論

大多數(shù)腫瘤中Lrig1表達(dá)缺失或減弱，而在有些腫瘤中表達(dá)上調(diào)［6-7］。Lrig1在腫瘤中表達(dá)的不一致性體現(xiàn)了Lrig1抑癌基因和癌基因的雙重性，研究發(fā)現(xiàn)Lrig1的雙重性可能與其蛋白的亞細(xì)胞定位有關(guān)，定位于細(xì)胞核周，其功能為抑癌基因作用，而定位于胞漿則為癌基因作用［8］。瑞典的學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，Lrig1蛋白在食管癌核周及胞漿均有表達(dá)，但主要定位于胞漿［9］。本研究在48例食管癌標(biāo)本中檢測(cè)Lrig1 mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Lrig1在多數(shù)腫瘤組織中有弱表達(dá)，表現(xiàn)為抑癌基因作用；但其在個(gè)別腫瘤組織中高表達(dá)，且Lrig1在腫瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于遠(yuǎn)端正常組織，表現(xiàn)為癌基因作用。據(jù)此推測(cè)Lrig1在哈薩克族食管癌患者中，可能起到癌基因與抑癌基因雙重作用，該作用是否與其蛋白的亞細(xì)胞定位有關(guān)，有待進(jìn)一步的研究。

MMP-2通過(guò)與細(xì)胞粘附分子相互作用降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，腫瘤細(xì)胞可以在MMP-2的作用下將基底膜成分降解形成孔隙樣結(jié)構(gòu)，并在其他基因產(chǎn)物的協(xié)同作用下完成侵襲過(guò)程，調(diào)控腫瘤新生血管形成，與腫瘤浸潤(rùn)相關(guān)［10-11］。核轉(zhuǎn)錄NF-κB是廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子，除主要參與炎癥和自身免疫反應(yīng)相關(guān)的基因調(diào)控，近些年來(lái)發(fā)現(xiàn)NF-κB對(duì)腫瘤的起源、發(fā)展、血管新生和轉(zhuǎn)移及腫瘤細(xì)胞凋亡具有重要作用［12-13］。

本研究發(fā)現(xiàn)NF-κB、MMP-2的表達(dá)與Lrig1有關(guān)，在Lrig1弱表達(dá)的標(biāo)本檢測(cè)到NF-κB及MMP-2基因的高表達(dá)，提示在哈薩克族食管癌患者中Lrig1與NF-κB、MMP-2可能存在一種負(fù)調(diào)控的關(guān)系，而采用Western blot進(jìn)行蛋白檢測(cè)的結(jié)果也驗(yàn)證了這種推測(cè)。Lrig1與NF-κB及MMP-2的調(diào)控又是通過(guò)何種途徑尚不清晰，NF-κB是MEK-ERK信號(hào)通路的下游因子［14］，可調(diào)控MMP-2的表達(dá)從而影響腫瘤的浸潤(rùn)［15-16］。Lrig1 是否通過(guò)調(diào)控NF-κ B進(jìn)而調(diào)節(jié)MMP-2表達(dá)，影響腫瘤的浸潤(rùn)，需要進(jìn)一步深入的研究。本研究通過(guò)檢測(cè)MEK-ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及PI3K-AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的關(guān)鍵因子，發(fā)現(xiàn)MEK5、ERK2與Lrig1表達(dá)相關(guān)，而MEK1及MEK2無(wú)論在Lrig1陽(yáng)性及陰性表達(dá)的標(biāo)本中均高表達(dá)，雖然統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示與Lrig1的表達(dá)不存在關(guān)聯(lián)，但哈薩克族食管癌患者中MEK1及MEK2是一種高表達(dá)狀態(tài)。這提示Lrig1與NF-κB及MMP-2的協(xié)同表達(dá)可能與MEK-ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)。

綜上所述，本研究提示在新疆哈薩克族食管癌患者中Lrig1可能主要是通過(guò)MEK-ERK信號(hào)通路調(diào)控NF-κB及MMP-2的表達(dá)，從而影響腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

1 Guo B,Huang ZL.Esophageal cancer mortality trends in rural and urban China between 1987 and 2009[J].Asian Pac J Cancer Prev,2011,12(8):2105-2110.

2 趙鳳娟,云妙英,張 嚴(yán),等.新疆哈薩克族食管癌研究進(jìn)展[J].中央民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2009,18(3):85-90.

3 Segatto O,Anastasil S,Alemà S.Regulation of epidermal growth factor receptor signalling by inducible feedback inhibitors[J].J Cell Sci,2011,124(Pt11):1785-1793.

4 邢細(xì)紅,王雄偉.LRIG1基因與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展[J].重慶醫(yī)學(xué),2010,40(11):1120-1122.

5 Lindstr?m AK,Asplund A,Hellberg D.Correlation between LRIG1 and LRIG2 expressions and expression of 11 tumor markers,with special reference to tumor suppressors,in CIN and normal cervical epithelium[J].Gynecol Oncol,2011,122(2):372-376.

6 Bhattacharjee A,Richards WG,Staunton J,et al.Classification of human lung carcinomas by mRNA expression profiling reveals distinct adenocarcinoma subclasses[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2001,98(24):13790-13795.

7 Krig SR,Frietze S,Simion C,et al.Lrig1 is an estrogen-regulated growth suppressor and correlates with longer relapse-free survival in ERa-positive breast cancer[J].Mol Cancer Res,2011,9(10):1406-1417.

8 Yi W,Haapasalo H,Holmlund C,et al.Expression of leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains(LRIG)proteins in human ependymoma relates to tumor location,Who grade,and patient age[J].Clin Neuropathol,2009,28(1):21-27.

9 Wu X,Hedman H,Bergqvist M,et al.Expression of EGFR and LRIG proteins in oesophageal carcinoma with emphasis on patient survival and cellular chemosensitivity[J].Acta Oncol,2012,51(1):69-76.

10 Pytliak M,Vargová V,Mechírová V.Matrix Metalloproteinases and their role in oncogenesis:a review[J].Onkologie,2012,35(1-2):49-53.

11 Bauvois B.New facets of matrix metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 as cell surface transducers:outside-in signaling and relationship to tumor progression[J].Biochim Biophys Acta,2012,1825(1):29-36.

12 Dolcet X,Llobet D,Pallares J,et al.NF-κB in development and progression of human cancer[J].Virchows Arch,2005,446(5):75-482.13 Xu L,Russu WA.Molecular docking and synthesis of novel quinazoline analogues as inhibitors of transcription factors NF-κB activation and their anti-cancer activities[J].Bioorg Med Chem,2013,21(2):540-546.

14 Yang XS,Liu SA,Liu JW,et al.Fucosyltransferase IV enhances expression of MMP-12 stimulated by EGF via the ERK1/2,p38 and NF-κB pathways in A431 cells[J].Asian Pac J Cancer Prev,2012,13(4):1657-1662.

15 Felx M,Guyot MC,Isler M,et al.Endothelin-1(ET-1)promotes MMP-2 and MMP-9 induction involving the transcription factor NF-kappaB in human osteosarcoma[J].Clin Sci(Lond),2006,110(6):645-654.

16 Shi MD,Shih YW,Lee YS,et al.Suppression of 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate-induced MCF-7 breast adenocarcinoma cells invasion/migration by a-tomatine through activating PKCa/ERK/NF-κB-dependent MMP-2/MMP-9 expressions[J].Cell Biochem Biophys,2012[Epub ahead of print].