郭 霞 劉開江 哈麗丹·熱依木 武貴臻 阿布力孜·阿布杜拉

新疆地區(qū)維吾爾族婦女宮頸癌發(fā)病率高（490～526/10萬例），死亡率是其他民族平均水平的3～4倍，被列為新疆特高發(fā)腫瘤之一［1］。研究開發(fā)最終篩選出特異靈敏的血漿腫瘤標(biāo)志物，是建立無創(chuàng)傷性早期診斷標(biāo)準(zhǔn)的重要切入點(diǎn)［2］。蛋白質(zhì)組學(xué)作為生命科學(xué)與技術(shù)的新一代引擎，帶動(dòng)了大量相關(guān)學(xué)科領(lǐng)域的快速發(fā)展。通過蛋白質(zhì)組學(xué)高通量表達(dá)特征譜和差異譜的分析，能夠從整體水平上獲得大量的信息。但是只有通過有針對(duì)性的數(shù)據(jù)挖掘和整合分析，才能從大量表達(dá)譜數(shù)據(jù)中提取出有生物學(xué)意義的信息，構(gòu)建出綜合性生物信號(hào)網(wǎng)絡(luò)與關(guān)系以及探測(cè)早期預(yù)警的標(biāo)記物，進(jìn)而達(dá)到解釋數(shù)據(jù)所蘊(yùn)含的重要的分子機(jī)制的目的［3］。本研究依托MetaCoreTM在線生物信息學(xué)分析平臺(tái)探討維吾爾族患者宮頸癌的發(fā)生與癌變機(jī)理以及尋找血漿預(yù)警蛋白。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

MetaCore（MetaCoreTMAnalysis）在線生物信息學(xué)分析平臺(tái)是美國GeneGo公司產(chǎn)品。

1.2 差異蛋白的MetaCoreTM生物信息學(xué)分析

基于前期研究針對(duì)維吾爾族宮頸癌患者血漿蛋白質(zhì)組學(xué)篩查和IPA@（Ingenuity Pathway Analysis）在線生物信息學(xué)軟件富集分析，最終獲得43個(gè)核心差異蛋白［4］，將其上傳至MetaCore數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行蛋白質(zhì)功能注釋與富集分析、信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建分析進(jìn)行分析。主要分析如下：1）蛋白質(zhì)功能注釋與富集分析（protein functional annotation and enrichment analysis），基于基因本體論（gene ontology）、京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）和在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（online mendelian inheritance in man，OMIM），對(duì)差異蛋白進(jìn)行功能注釋（protein functional annotation）、細(xì)胞內(nèi)組成（cellular component）以及在機(jī)體中所負(fù)責(zé)的生物學(xué)加工進(jìn)程（biological process）進(jìn)行富集分析（enrichment analysis），理解差異蛋白質(zhì)在已知的研究成熟的通路里其相互作用關(guān)系，鑒別對(duì)細(xì)胞和疾病表型有顯著影響的蛋白，并了解蛋白是如何影響表型的。2）信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建分析（network construction and analysis），根據(jù)軟件提供的網(wǎng)絡(luò)分析算法，設(shè)置網(wǎng)絡(luò)大小和關(guān)聯(lián)參數(shù)對(duì)該網(wǎng)絡(luò)生物相關(guān)背景進(jìn)行分析，創(chuàng)建差異蛋白質(zhì)的相互作用及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以便可以洞察與推測(cè)蛋白的分子作用機(jī)制。3）生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)與評(píng)估（biomarker assessment），是鑒于Meta-CoreTM數(shù)據(jù)庫的信息，通過使用“子宮頸疾病”進(jìn)行過濾，基于那些與研究發(fā)現(xiàn)最相關(guān)的生物特征，進(jìn)行有計(jì)劃地優(yōu)化與已知疾病相匹配的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，找到與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)最相關(guān)及最有可能的候選生物標(biāo)記。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌差異蛋白的MetaCoreTM生物信息學(xué)分析

2.1.1 蛋白質(zhì)功能注釋與富集分析結(jié)果 為了闡釋差異蛋白質(zhì)的生物特征和所影響的生物進(jìn)程，對(duì)每一個(gè)差異蛋白進(jìn)行生物功能注釋，并對(duì)差異蛋白進(jìn)行以下三個(gè)方面分析，以P＜0.1為有意義。

1）參與的生物學(xué)加工進(jìn)程：發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白的生物學(xué)功能多樣，而蛋白分布最為集中的主要生物學(xué)功能包括：細(xì)胞內(nèi)構(gòu)成的負(fù)調(diào)節(jié)、膽固醇反向轉(zhuǎn)運(yùn)、應(yīng)激反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)等共計(jì)24個(gè)（圖1A）。

2）細(xì)胞內(nèi)組成：在細(xì)胞內(nèi)的組成主要集中于高密度脂蛋白顆粒、血漿脂蛋白顆粒和脂蛋白復(fù)合體（圖1B）。

3）GeneGo網(wǎng)絡(luò)分布：基于對(duì)差異蛋白各種功能的富集分析，構(gòu)建出主要參與的功能網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)主要參與脂代謝中的膽汁酸代謝調(diào)節(jié)和受體依賴的膽汁酸濃縮負(fù)調(diào)節(jié)、炎癥補(bǔ)體系統(tǒng)、細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白纖維、ESR1膜受體轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和炎癥反應(yīng)IL-6途徑（圖2）。

圖1 差異蛋白負(fù)責(zé)的生物學(xué)加工進(jìn)程（A）和機(jī)體細(xì)胞內(nèi)組成（B）Figure1 Biological process of selected proteins（A）and cellular component distribution（B）

圖2 差異蛋白的GeneGo網(wǎng)絡(luò)分布的富集分析Figure2 GeneGo network distribution of selected proteins

2.1.2 信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建分析結(jié)果 通過Meta-Core最短路徑算法分析構(gòu)建出差異蛋白功能和相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（圖3）。

2.1.3 生物標(biāo)志物的篩選分析 通過生物標(biāo)志物的篩選與優(yōu)化候選生物標(biāo)記分析，從43個(gè)核心差異蛋白中找到與宮頸病變與宮頸癌最相關(guān)及最有可能的4個(gè)候選生物標(biāo)記（表1），分別是抗凝血酶Ⅲ（AntithrombinⅢ，ATⅢ）、凝集素（clusterin，CLU）、絨毛蛋白1（villin 1，VIL1）和免疫球蛋白κ（immunoglobulin kappa locus，IGKκ），如表1所示信息，并且構(gòu)建出這4個(gè)蛋白相互作用圖（圖4），圖中清楚地標(biāo)示出其主要調(diào)節(jié)蛋白。

圖3 通過MetaCore最短路徑算法分析構(gòu)建差異蛋白功能和相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Figure3 MetaCore network of selected proteins constructed using shortest path algorithm

表1 宮頸癌患者血漿生物標(biāo)志物的篩選分析Table1 Biomarker filter analysis of the differentially expressed proteins of plasma proteome between patients with cervical cancer and cervicitis

圖4 宮頸疾病候選生物標(biāo)志物的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建圖Figure4 Networks of candidate biomarkers of uterine cervical diseases

3 討論

本研究運(yùn)用的MetaCoreTM的分析平臺(tái)是基于一個(gè)獨(dú)特的、申請(qǐng)專利的、高質(zhì)量的人工修正的數(shù)據(jù)庫，包括各種蛋白-蛋白和蛋白-DNA相互作用網(wǎng)絡(luò)、各種轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝反應(yīng)通路以及各種生物活性分子的數(shù)據(jù)，整合了“數(shù)據(jù)挖掘”工具包，能夠提供可信的資源在一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)系統(tǒng)中解釋實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

本研究分析發(fā)現(xiàn)在宮頸癌階段機(jī)體的物質(zhì)代謝尤其是脂代謝調(diào)節(jié)發(fā)生紊亂。并且分析推測(cè)，長期的慢性炎癥和人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染并存，導(dǎo)致細(xì)胞微環(huán)境的改變，炎癥補(bǔ)體系統(tǒng)和通路激活，活化下游不同的效應(yīng)物轉(zhuǎn)錄因子，擾動(dòng)了機(jī)體各個(gè)方面的調(diào)節(jié)，激活了惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞學(xué)與分子學(xué)機(jī)制，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、永生和遷徙，是宮頸癌發(fā)生與發(fā)展的始動(dòng)因素［5］。

通過生物標(biāo)志物的篩選分析，篩查出與宮頸癌最相關(guān)及最有可能的4個(gè)候選生物標(biāo)記，分別是ATⅢ、CLU、VIL1和IGK@，構(gòu)建了它們之間的相互作用圖。發(fā)現(xiàn)CLU、VIL1和IGK@均對(duì)NFκB和COX-2有激活作用，而NF-κB等這些轉(zhuǎn)錄因子均是炎癥持續(xù)相關(guān)的重要介質(zhì)釋放的主要調(diào)控器，這些通路的活化會(huì)形成惡性循環(huán)。又發(fā)現(xiàn)CLU通過BCL-XL和BAX蛋白，IGK@通過BCL-6抑制細(xì)胞的凋亡，因此最終不僅導(dǎo)致細(xì)胞增殖又抑制細(xì)胞凋亡，促使炎癥加重、惡化和腫瘤形成。

抗凝血酶Ⅲ（ATⅢ）能夠滅活多種凝血酶而發(fā)揮抗凝功能，本研究篩查出其在宮頸癌患者血漿中表達(dá)降低，認(rèn)為在腫瘤階段可能出現(xiàn)復(fù)雜的凝血-抗凝-纖溶系統(tǒng)的改變，總體的抗凝功能降低，表現(xiàn)為復(fù)雜的血栓前狀態(tài)，這種狀態(tài)有利于癌栓形成，易于癌細(xì)胞的黏附、浸潤和轉(zhuǎn)移［6］。近年研究發(fā)現(xiàn)，抗凝血酶具有抗血管新生、抑制細(xì)胞增殖等抗腫瘤的作用［7］。凝集素（CLU）是一種異源二聚體硫酸化糖蛋白，涉及衰老、腫瘤的發(fā)生發(fā)展、血管損傷等多種生理和病理過程，在多種惡性腫瘤和癌前病變中上調(diào)表達(dá)，可作為其早期預(yù)警以及腫瘤預(yù)后評(píng)價(jià)的參考指標(biāo)［8］。IGK@蛋白目前的研究報(bào)道很少，但是在多種體液蛋白質(zhì)組學(xué)研究中都被篩查出［9］。本研究結(jié)果表明其在宮頸癌患者血漿中表達(dá)上調(diào)，可以為后續(xù)該蛋白的研究提供例證。絨毛蛋白1（VIL1）是鈣調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白家族的成員，具有肌動(dòng)絲封蓋，切斷，捆綁功能［10］。最近報(bào)道證明絨毛蛋白1是上皮性細(xì)胞抗凋亡蛋白，可以用來輔助明確轉(zhuǎn)移性腫瘤的來源，是腸上皮細(xì)胞分化和轉(zhuǎn)移性腸腺癌［11］、宮頸腺癌［10］相對(duì)敏感的特異性標(biāo)志。

綜上所述，本研究基于生物信息學(xué)對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)挖掘分析，闡釋了宮頸癌發(fā)生的機(jī)理，篩選出的ATⅢ、CLU、IGK@和VIL1可以作為宮頸癌的早期預(yù)警候選標(biāo)志蛋白。

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