馮 琦，王 永，武東玲，魏躍偉，崔 紅*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院，鄭州 450002；2.三門峽市煙草公司澠池分公司，河南 澠池 472044）

腺毛是植物表面的特化器官。作為植物“感受器”，它能夠感受外界環(huán)境細微的壓力并誘導一系列防御反應(yīng)[1]。人們發(fā)現(xiàn)茉莉酸及其衍生物（JAs）對腺毛防御具有重要作用。外源茉莉酸可替代傷害刺激，有效地促進植物新生葉片腺毛密度大幅度增加[2-4]。煙草莖葉腺毛密布，種類繁多，分泌旺盛。在水分脅迫條件下，腺毛細胞中葉綠體類囊體膜降解，高電子致密物質(zhì)逐漸增多[5]，煙葉表面西柏三烯二醇的含量升高[6]；在遮蔭條件下，腺毛葉綠體類囊體片層發(fā)達，葉綠素熒光強烈，黑色嗜鋨顆粒稀少，葉面西柏烷類化合物的含量大大降低[7]。逆境條件下腺毛形態(tài)學和物質(zhì)代謝所發(fā)生的變化，說明煙草腺毛在煙株防御過程中具有重要作用，對其反應(yīng)機制的深入解析是實現(xiàn)高效調(diào)控的重要前提。

本試驗采用外源茉莉酸甲酯（MeJA）處理煙苗，并對葉片腺毛密度結(jié)構(gòu)、葉面化學組分及蚜蟲趨避性進行分析檢測，研究MeJA對煙草腺毛形態(tài)發(fā)生、物質(zhì)代謝和煙株抗性的影響，并探討煙草腺毛防御系統(tǒng)的反應(yīng)機制，為煙草腺毛防御代謝工程奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以煙草品種中煙100為材料，依照《優(yōu)質(zhì)煙栽培技術(shù)規(guī)范》進行漂浮育苗，成苗后移栽到花盆。1個月后選擇生長態(tài)勢一致的煙株，用 0.8 mM MeJA（無水乙醇含量 0.8%）充分噴施，對照組用0.8%的無水乙醇溶液處理，對照和處理組隔離3 d后，隨機擺放在實驗網(wǎng)棚中培養(yǎng)。試驗于2011年6月1日移栽，8月30日結(jié)束，試驗期間平均氣溫26.1 ℃。

1.2 試驗方法

1.2.1 腺毛密度統(tǒng)計及形態(tài)觀察 自煙株處理后，待頂部第1片新葉長到10 cm時，小心摘取，直接撕取葉片下表皮在MOTIC光學顯微鏡下統(tǒng)計腺毛密度[8]。新鮮葉片沿主脈兩側(cè)切下約5 mm×8 mm的平整小塊葉片，直接使用VEGA Ⅱ LMU掃描電子顯微鏡（Tescan公司，捷克）觀察葉片下表面腺毛形態(tài)及類型，并拍照。掃描電鏡采用氣體二次電子成像，工作電壓 20 kV，工作距離 21 mm（21.25～21.70 mm），樣品室和鏡筒狀態(tài)選用高真空（10-6Pa）。

1.2.2 葉面化學成分分析 采用有機溶劑萃取的方法[9]，對MeJA處理后0、3、7、11 d的葉片進行葉面化學成分提取，并采用紫外分光光度計法[10]進行葉面化學成分總量檢測。

對處理后第 7天的葉面化學成分進行 GC/MS檢測：于二氯甲烷提取液中加入內(nèi)標（2.020 mg/mL的蔗糖八乙酸酯和 2.542 mg/mL的正十七烷醇的500 mL二氯甲烷溶液）1 mL，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，硅烷化處理后，采用 GC/MS與微機聯(lián)用進行定性、定量分析。色譜儀為HP-5890，質(zhì)譜儀是vc-70SE。GC條件：色譜柱：DB-5MSUI石英毛細管柱（30 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm d.f.)；進樣口溫度：250 ℃；程序升溫：40 ℃保持2 min，然后以6 ℃/min升溫至180 ℃保持2 min，以2 ℃/min升溫至280 ℃保持20 min；載氣：高純氦氣；載氣流速：恒流0.8 mL/min；進樣量：1.0 μL，分流比：15:1。MS條件：傳輸線溫度：250 ℃；EI離子源溫度：280 ℃；電離能量：70 eV；質(zhì)量數(shù)范圍50～650 amu；檢索譜庫：NIST08。

1.2.3 葉面腺毛基因表達分析 葉片腺毛的獲得：參照文獻[11]的方法進行改良。選取幼嫩健康的葉片液氮中低溫固定形態(tài)5 min，使用硬度適中的毛刷由葉基向葉尖方向?qū)⑾倜⒅潦⒂羞m量液氮的研缽中，每個樣品刷取約100 cm2的葉片，刷取完成后直接研磨提取。

腺毛 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄：RNA提取使用QIAGEN公司的RNeasy Plant Mini Kit試劑盒，反轉(zhuǎn)錄使用 NEWBIO INDUSTRY公司生產(chǎn)的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，反轉(zhuǎn)錄的cDNA用于PCR檢測。

引物設(shè)計：采用Premier Prime 5.0軟件，根據(jù)Genbank發(fā)布的L25、DXR、CBT和CYP71D16序列設(shè)計各基因擴增引物（表1），用于PCR檢測。其中L25是煙草核糖體蛋白[12]，本研究中作為內(nèi)參基因。

PCR檢測：PCR反應(yīng)體系為20 μL。PCR擴增程序為：94 ℃ 5 min 預(yù)變性；94 ℃ 30 sec變性，48～51 ℃ 30 sec退火（具體按各引物Tm值設(shè)定），72 ℃1 min延伸，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

結(jié)果檢測：PCR產(chǎn)物使用 1.5%瓊脂糖凝膠進行檢測，并使用 Manual BioSpectrum Imaging System（UVP公司，美國）進行觀察拍照。

1.2.4 蚜蟲選擇性試驗 分別選擇處理與對照兩片幼葉，分別置于15 cm直徑的培養(yǎng)皿中；挑選健康的無翅蚜于一小玻璃杯中，將玻璃杯等距離倒扣在葉片之間，輕敲杯底使蚜蟲掉落于培養(yǎng)皿上，移去玻璃杯，使蚜蟲自由活動；于 24 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 h后，統(tǒng)計處理與對照葉片上的蚜蟲數(shù)。結(jié)果為3次重復(fù)的平均值。

表1 擴增引物序列Table 1 Primer sequence

2 結(jié) 果

2.1 MeJA處理對腺毛形態(tài)發(fā)生的影響

MeJA噴施煙株后，對新葉進行掃描電鏡觀察，結(jié)果如圖1所示?？梢钥闯?，MeJA處理煙株的新葉，腺毛密度高，且長柄多腺頭腺毛較多，體型較大（圖1-A），而對照煙株葉片腺毛密度相對較低，體型較小，長柄單細胞腺頭腺毛較多（圖1-B）。體視鏡下對葉片下表皮的腺毛腺密度進行統(tǒng)計，結(jié)果如圖2所示?？梢钥闯?，MeJA處理與對照相比，煙株新葉腺毛密度有所提高；但短柄腺毛以及無頭腺毛密度差異不顯著，長柄腺毛尤其是長柄多腺頭細胞差異達到顯著水平。

圖1 MeJA處理對葉面腺毛形態(tài)的影響Fig.1 Effect of treatment on leaf trichomes shape

圖2 MeJA處理對煙株第1片新葉腺毛密度的影響Fig.2 Effect of MeJA spraying on trichomes density of the first new leaf

2.2 葉面化學成分分析

利用分光光度法，對MeJA處理后不同時間的葉片進行葉面成分分析，葉面化學成分總量變化趨勢如圖3所示。可以看出，在第3天，MeJA處理的葉片和對照葉片在葉面化學成分含量上就有明顯不同。雖然，隨著時間的延長，對照煙株葉面分泌物也呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢，但MeJA處理能使煙株葉面分泌物含量大幅度提高，并在處理后第7天達到積累高峰，隨后有所下降，但仍顯著高于對照。

采用GC/MS技術(shù)，對處理后第7天的煙株葉面分泌物成分進行檢測，峰值圖如圖4所示，結(jié)果見表2。從中可以發(fā)現(xiàn)，無論是在處理還是對照中，西柏三烯二醇都是葉面化學成分中含量最高的組分；在MeJA處理后，該組分含量顯著增加，說明MeJA刺激誘導了該物質(zhì)的生物合成和積累。烷烴類物質(zhì)種類繁多，難以準確定性；與對照相比，MeJA處理葉片中烷烴類物質(zhì)含量大多表現(xiàn)出小幅度增加的趨勢。實驗中檢測到5種蔗糖酯類物質(zhì)，與對照相比，在MeJA處理葉片中各有升降，但變幅不大，說明該類物質(zhì)受MeJA的影響并不顯著。

圖3 葉面分泌物含量變化趨勢Fig.3 Changes of leaf secretion

圖4 MeJA噴施第7天葉面分泌物化學峰值比較Fig.4 Comparison of the leaf secretion on the 7th day

表2 MeJA噴施第7天葉面分泌物化學成分分析Table 2 Chemical constituents of the leaf secretion on the 7th day

2.3 基因表達分析

在MeJA處理后，分別在處理0 d和處理后1、2、3、4、5、6、7 d刷取葉面腺毛，提取腺毛總 RNA，利用RT-PCR技術(shù)檢測萜類代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的表達變化，如圖5所示。脫氧磷酸木酮糖還原異構(gòu)酶（DXR）催化脫氧磷酸木酮糖（DXP）形成甲基赤鮮糖醇-4-磷酸（MEP），是類萜代謝前體物質(zhì)異戊二烯（IPP）合成的關(guān)鍵酶。西柏三烯一醇合成酶（CBT）是二萜環(huán)化酶，催化牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（GGPP）向西柏三烯一醇的轉(zhuǎn)化，西柏三烯一醇羥化酶（CYP71D16）則催化西柏三烯一醇向西柏三烯二醇的轉(zhuǎn)化。這三個酶的基因與葉面腺毛主要分泌物的合成密切相關(guān)，但RT-PCR結(jié)果表明，三基因的轉(zhuǎn)錄均未隨MeJA的處理而發(fā)生明顯的變化。

圖5 腺毛二萜代謝相關(guān)基因表達分析Fig.5 Gene expression analysis by RT-PCR

2.4 MeJA處理對煙株蚜蟲抗性的影響

MeJA噴施處理7 d后，對煙株幼葉進行蚜蟲選擇性實驗。在放有處理和對照葉片的密閉容器中（圖6-A），無翅蚜通過爬行尋找喜好的棲身之地。7 h之后，統(tǒng)計葉片上的蚜蟲數(shù)目，發(fā)現(xiàn)更多的蚜蟲集聚在未噴施 MeJA的葉片上（圖 6-B）。表明MeJA處理使得葉片對蚜蟲的驅(qū)避性增強。

圖6 葉片對蚜蟲的抗性比較Fig.6 Comparison of the leaf resistance to aphid

3 討 論

煙株莖、葉表面覆蓋著濃密的腺毛。它不僅形成了煙株與環(huán)境間的物理屏障，腺毛主要分泌物-西柏烷類二萜化合物也構(gòu)筑了煙株抵御病原微生物侵襲的化學防線。由煙草腺毛構(gòu)筑的煙草葉面防御體系，是煙株防御體系的重要組成部分，但目前人們對其反應(yīng)模式及作用機制尚缺乏認識。

本實驗采用MeJA噴灑煙株后，葉片對蚜蟲的驅(qū)避效果證明煙草葉面防御能力得到了增強。處理后煙株新生葉片腺毛密度發(fā)生了明顯變化，但只有長柄多腺頭腺毛的差異達到了顯著水平。長柄多細胞腺頭腺毛是煙草腺毛中分泌最旺盛的類型，說明MeJA對煙草分泌型腺毛誘導的選擇性。這與同樣為多腺毛類型植物的番茄研究結(jié)果相同[2]。但在Traw等[4]的報道中，擬南芥腺毛雖為單一的非分泌型腺毛，它的發(fā)生也受到MeJA的強烈誘導，表明了不同植物中腺毛發(fā)生誘導機制的不同。在已發(fā)育葉片中，MeJA處理對腺毛密度和類型產(chǎn)生影響不大，但卻使煙株葉面化學成分發(fā)生了明顯變化，尤其是腺毛分泌物——西柏烷類化合物含量明顯提高。在有關(guān)曼陀羅腺毛的研究[13]中報道，MeJA處理并不改變腺毛的密度及類型，卻可以使腺毛主要分泌物acylsugars的含量提高44%。在番茄研究[14]中發(fā)現(xiàn)，MeJA處理可誘導腺毛單萜環(huán)化酶LeMTS1的活躍表達。但本實驗中，對煙草葉面腺毛基因表達分析表明，與煙草腺毛分泌物——西柏烷類化合物合成相關(guān)的基因在轉(zhuǎn)錄水平并未受到MeJA的誘導。關(guān)于植物類萜代謝中DXS，DXR和HDR酶受到轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)已被研究所證實[15]，因此推測煙草腺毛中二萜化合物的生物合成存在著相同的調(diào)節(jié)機制。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)：（1）噴施MeJA能誘導煙草葉面防御反應(yīng)，使葉片對蚜蟲的驅(qū)避性增強；（2）煙草葉面防御反應(yīng)的主要表現(xiàn)是誘導了分泌型腺毛的發(fā)生，是導致西柏烷類化合物為主的葉面分泌物增加的主要原因；（3）西柏烷類化合物合成相關(guān)的基因在轉(zhuǎn)錄水平上并不受MeJA的誘導，推測煙草二萜代謝具有較復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機制。

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