唐元瑜 水楠楠

（福建中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，中醫(yī)基礎理論內(nèi)經(jīng)教研室，福州350108）

油紅O為活性很強的脂溶性染料，在組織或細胞的脂質(zhì)中高度溶解，與類脂有較強的親和力，具有使脂肪組織或細胞內(nèi)脂滴特異性著色的特性，常被廣泛用于體內(nèi)儲脂細胞如原代未活化的肝、胰星狀細胞和前脂肪細胞的染色鑒定。

研究表明：胰腺纖維化是和慢性胰腺炎、胰腺癌密切相關的一種病理變化，而胰腺星狀細胞（pancreatic stellate cells，PSCs）則是胰腺纖維化發(fā)生的主要效應細胞［1］。在生理情況下，胰腺星狀細胞處于靜止未活化狀態(tài)（quiescence），胞質(zhì)內(nèi)含有較豐富的維生素A和脂滴；病理狀況下，多種刺激因子如炎性因子、酒精及其代謝產(chǎn)物、氧化應激等則可刺激其活化增殖，使細胞表型發(fā)生改變，轉(zhuǎn)化為肌纖維母細胞，同時胞質(zhì)內(nèi)的脂肪滴逐漸減少，甚者消失［2，3］。本實驗利用該細胞這一生物學特性，對原代培養(yǎng)的未活化胰腺星狀細胞脂肪滴進行了染色鑒定，現(xiàn)將結果報道如下。

材料和方法

1．材料

油紅O（AR，上海國藥集團化學試劑有限公司，批號：WSIG201008032），異丙醇（AR，天津市致遠化學試劑有限公司，批號：WSIG20101106），pH7．4磷酸鹽緩沖液（由 NaCl 8．00g KCl 0．20g Na2HPO4·12H2O2．82g KH2PO40．20g組成），400g／L甲醛液（AR，西隴化工股份有限公司，批號：1103032）。電熱恒溫水浴箱（上海精宏實驗設備有限公司，型號：DK－S24），倒置生物顯微鏡（日本尼康公司，型號：Ti－S系列 ）。

2．方法

2．1原代小鼠胰腺星狀細胞的分離與培養(yǎng)

參考國外學者Kruse［4］及本文作者建立的方法［5］，主要包括取胰、消化、植塊培養(yǎng)等步驟。受試細胞選用原代培養(yǎng)4天的未活化胰腺星狀細胞。

2．2油紅O染液的配制

電子天平稱取油紅O粉末0．25g，放入50mL康寧螺口帶蓋的塑料錐形離心管中，添加異丙醇有機溶劑，定容至50mL，加蓋，封口膜密封，置離心管于60℃電熱恒溫水浴箱中，加熱溶解30min，中途顛倒搖晃2－3次以助溶，定性濾紙過濾，即得濃度為5g／L的飽和油紅O母液。

臨用時，取上述5g／L油紅O母液，與蒸餾水按體積比6∶4在50mL康寧螺口帶蓋的塑料錐型離心管中混勻后，加蓋靜置30min，小心吸取上清，定性濾紙再次過濾，即得油紅O工作染液。

2．3油紅O染色原代小鼠胰星狀細胞脂肪滴

主要包括漂洗、固定、浸染、脫色以及復染等步驟，即：用巴氏滴管吸取2mL37℃預熱的磷酸鹽緩沖液于接種有原代胰腺星狀細胞的6孔板中，作十字形晃動，輕輕漂洗貼壁細胞2遍后，用濾紙吸盡孔中殘存的磷酸鹽緩沖液，加入1mL 100g／L甲醛液常溫下固定15min，棄之，再次予磷酸鹽緩沖液輕輕漂洗固定的細胞2遍，然后沿孔壁緩慢加入3mL新鮮配制的油紅O工作液，加蓋，封口膜密封，在倒置生物顯微鏡下開始作動態(tài)觀察。

若鏡下觀察到脂肪滴顏色逐漸加深，呈鮮紅的、大小不一的串珠樣時，即可吸盡油紅O染液終止染色，并用磷酸鹽緩沖液小心漂洗2－3遍后，加入蘇木素液淡染胞核30S，再次予磷酸鹽緩沖液漂洗分化脫色，即可鏡下顯微成像。

結 果

1．胰腺星狀細胞活化前后的形態(tài)學比較

在倒置生物顯微鏡×200倍視野下，未活化的胰腺星狀細胞形態(tài)主要表現(xiàn)為胞核較大，呈卵圓形，核仁明顯，細胞質(zhì)粗糙，顆粒樣物質(zhì)充滿其中，將細胞核圍繞成“空泡樣”的戒環(huán)狀?；罨囊认傩菭罴毎麆t體積較大，扁平，偽足發(fā)達，成“星芒狀”或“烏賊樣”。（圖1A，1B）

2．油紅O染色未活化胰腺星狀細胞脂肪滴的觀察

未活化的胰腺星狀細胞脂肪滴被油紅O染成鮮艷的紅色，大小不一的串珠樣“油珠子”分散于胞質(zhì)中，簇集成“環(huán)狀”，呈戒環(huán)樣包繞在細胞核周圍。（圖1C，1D）

討 論

原代未活化的胰腺星狀細胞是一類胞漿內(nèi)含有天然熒光素維生素A和脂肪滴的特殊類型的儲脂細胞，而油紅O能高度溶解于脂肪中，與其有較好的親和力。利用該細胞這一生物學特性，我們予5g／L油紅O飽和液對其進行了染色和鑒定，觀察到未活化的胰腺星狀細胞脂肪滴被油紅O染成鮮艷的紅色，大小不一的串珠樣“油珠子”分散于胞質(zhì)中，簇集成“環(huán)狀”，呈戒環(huán)樣包繞在細胞核周圍，從而證實了培養(yǎng)的原代胰腺星狀細胞含有脂肪滴這一重要生物學特征。

在本次試驗中，我們體會到：選擇合適的受試細胞，把握好染色時間是進行油紅染色原代未活化胰腺星狀細胞實驗的關鍵。對于該細胞脂滴染色的時間，我們一般選擇在置塊培養(yǎng)的4－5天時間進行，因為該時間點上細胞剛從組織塊爬出，脂肪滴含量較多，容易著色，背景干凈。此外，油紅O的正確配制和洗脫也是降低背景，提高信噪比的關鍵。由于油紅O難溶于水，易溶于異丙醇、乙醇等有機溶劑，0．5g油紅O在100mL異丙醇溶液中即可達到飽和，所以臨用前需采用過濾的方法除去不溶性的油紅顆粒及雜質(zhì)。為此，我們采用定性濾紙兩次過濾結合自然沉降法，避免了染色時不溶性油紅顆粒及雜質(zhì)在背景的沉積。對于油紅的漂洗，文獻報道常常使用600g／L的異丙醇或乙醇進行分化脫色［6，7］，而我們則直接使用磷酸鹽緩沖液輕輕漂洗3遍，也同樣達到了消除背景油紅顏色的目的。此外，在染色過程中，加蓋密封以避免異丙醇揮發(fā)；添加油紅染液的量宜寧多勿少；蘇木素復染前應小心吸取上清液以減少顆粒沉積，也都是降低背景，增加信噪比的重要措施。

由于油紅O在胞漿中是以脂滴的三維立體形式存在，且大小不一，顯微鏡聚焦時，細胞的焦點與油紅焦點可能不在一個層面上，所以細胞的顯微成像攝影技術也是油紅染色觀察成功與否的重要措施之一。我們體會到脂滴的觀察視野以×200放大倍數(shù)為最佳，同時配合顯微鏡的相差功能以及白平衡功能，即可獲得理想的成像效果。

總之，采用油紅O染色原代未活化的胰腺星狀細胞脂肪滴，是鑒定該細胞的重要方法之一，其步驟簡單，結果直觀，重復性高，值得學習和借薦。

圖 版 說 明

圖1 胰腺星狀細胞活化前后的形態(tài)學比較及油紅O染色脂肪滴的觀察．A：未活化的胰星狀細胞（×200）；B：活化的胰星狀細胞（×200）；C：油紅染色未活化胰星狀細胞（×100）；D：油紅染色未活化胰星狀細胞（×200）；E：蘇木素襯染未過濾造成的蘭黑色顆粒沉積；F：異丙醇揮發(fā)造成的紅褐色顆粒沉積

EXPLANATION OF FIGURES

Fig．1The comparison of morphology of pancreatic stellate cells which is activated and quiescent and Experimental observation of the primary pancreatic stellate cells stained by Oil red O

A：pancreatic stellate cells unctivated（×200）；B：pancreatic stellate cells activated （× 200）； C：morphology of the primary pancreatic stellate cells stained by Oil red O（×100）；D：morphology of the primary pancreatic stellate cells stained by Oil red O（×200）；E：Dark blue particle deposition which is brought about by unfiltered Hematoxylin；F：Reddishbrown particle deposition which is brought about by Isopropanol volatile

［1］王興鵬．胰腺星狀細胞與胰腺纖維化．胰腺病學，2004，4（2）：72－75

［2］張汝玲，王興鵬．慢性胰腺炎胰腺纖維化發(fā)生機制及抗纖維化治療進展．胰腺病學，2001，1（1）：56－58

［3］余曉云，陳婕，侯曉華．胰腺星狀細胞活化相關因子研究進展．世界華人消化雜志，2006，14（20）：2009－2013

［4］Kruse，Marie－Luise．Isolation，Long－term Culture and Characterization of Rat Pancreatic Fibroblastoid／Stellate Cells．Pancreas，2001，23（1）：49－54

［5］唐元瑜，蘇式兵．小鼠胰星狀細胞的分離培養(yǎng)及鑒定．世界華人消化雜志，2010，18（1）：28

［6］崔葉青，李嘉，劉爽等．油紅O染色鑒定胰腺星狀細胞．中國組織化學與細胞化學雜志，2010，19（5）：522－523

［7］田玉旺，李琳，李麗等．介紹一種改良的油紅O脂肪染色法．中國組織化學與細胞化學雜志，2007，16（6）：736