王燕舞 黎 莉 孟運蓮

（武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 湖北430071）

黏膜是機體與外界相隔的最大屏障，也是外源抗原進入機體的主要途徑，黏膜免疫是免疫系統(tǒng)中一個特殊的組成部分。黏膜免疫主要由分布于消化道、呼吸道和泌尿生殖道的黏膜相關(guān)淋巴組織執(zhí)行。女性生殖道的黏膜免疫和人體其它部分一樣，抵御病原體的入侵，由于涉及到精子和胚胎的耐受，具有特殊性。因此研究女性生殖道的黏膜免疫對于進一步了解生殖過程有著重要的意義。

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，Ct）是女性生殖道感染最常見的致病菌，因其癥狀隱匿性，常常被女性所忽視。然而，因沙眼衣原體感染導(dǎo)致的不孕不育、異位妊娠等嚴(yán)重并發(fā)癥使其日益受醫(yī)學(xué)界重視［1］。大量研究已證實生殖道黏膜免疫反應(yīng)與沙眼衣原體感染造成機體組織損傷有重大關(guān)聯(lián)［2］。沙眼衣原體感染常用阿奇霉素或多西環(huán)素治療［3］。有研究表明，多種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素如紅霉素、克拉霉素及阿奇霉素對免疫系統(tǒng)具有一定的調(diào)節(jié)活性，例如抑制中性粒細胞趨化、突發(fā)性氧化作用及單核細胞促炎癥細胞因子的釋放等［4］。而近年來研究發(fā)現(xiàn)，阿奇霉素也可在一定程度上抑制促炎癥細胞因子的產(chǎn)生［5］。

鑒于此，對阿奇霉素治療后生殖道沙眼衣原體感染的黏膜免疫狀況進行研究，不僅能明確其對感染后黏膜免疫的影響，也可以指導(dǎo)臨床用藥、預(yù)測疾病的轉(zhuǎn)歸。

材料和方法

1．動物分組和沙眼衣原體感染模型構(gòu)建

將沙眼衣原體E型株（武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院保存），在hela細胞中培養(yǎng)擴增，收集細胞后，高速離心分離衣原體。

SPF級成年雌性BALB／c小鼠，由武漢大學(xué)動物實驗中心出售。小鼠皮下注射黃體酮（浙江仙琚制藥股份有限公司）2．5mg／只，連續(xù)7天，給足食、水，籠中喂養(yǎng)。7天后，38只建模小鼠用1ml的無菌注射器，通過陰道在子宮角接種沙眼衣原體（106IFU／ml，30ul）；對照組6只小鼠，用不含衣原體的hela細胞培養(yǎng)液接種（30μl）。接種7天后取陰道拭子分離沙眼衣原體，檢測感染的陽性率。

將建模成功的小鼠隨機分為兩組：生理鹽水組和阿奇霉素組。阿奇霉素組給予阿奇霉素（希舒美，輝瑞制藥有限公司）80mg／kg［6］，灌胃，1 次。對照組和生理鹽水組給予等量無菌生理鹽水灌胃。

2．免疫學(xué)檢測

2．1標(biāo)本采集

給藥當(dāng)天、給藥7天、14天、21天分別取小鼠陰道拭子進行沙眼衣原體的分離，檢測沙眼衣原體的感染。給藥第七天給藥21天摘眼球取血，頸椎脫臼法處死小鼠，取出完整陰道和子宮。迅速放入4%多聚甲醛中固定24h，常規(guī)石蠟切片，用于HE染色、肥大細胞染色和免疫組化檢測。

2．2肥大細胞染色

甲苯胺藍染液配制：甲苯胺藍（北京化學(xué)試劑公司）1g溶于100ml蒸餾水。石蠟切片脫蠟入水，1%甲苯胺藍染液2min；自來水洗2次，去掉浮色；常規(guī)酒精脫水，二甲苯透明，封片。

2．3免疫組織化學(xué)染色

采用SABC染色法。用已知陽性片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。實驗使用兔多克隆抗體Anti－CD11c（樹突狀細胞標(biāo)志物，購自北京博奧森生物技術(shù)公司），稀釋度1∶100。SABC試劑盒和二氨基聯(lián)苯（DAB）顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

2．4血清中IL－6和TNF－a濃度測定

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定三組小鼠血清中IL－6和TNF－a的濃度，小鼠ELISA試劑盒購自美國R＆D system公司。按試劑盒說明書進行檢測。

2．5統(tǒng)計學(xué)分析

各指標(biāo)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組實驗數(shù)據(jù)均用SPSS統(tǒng)計軟件進行分析，以P＜0．05為差異有顯著性。

結(jié) 果

1．構(gòu)建生殖道沙眼衣原體感染動物模型

建模小鼠外陰出現(xiàn)輕微感染癥狀，略顯紅腫，分泌物稍多，顏色清亮，部分小鼠出現(xiàn)毛發(fā)脫落；阿奇霉素治療后，小鼠外陰基本正常，無分泌物。

2．小鼠生殖道沙眼衣原體感染率

陰道拭子分離培養(yǎng)結(jié)果顯示，對照組陽性率為0，說明實驗過程無污染。給藥21天生理鹽水組的自然轉(zhuǎn)陰率約20%左右。給藥7天，阿奇霉素組衣原體感染率降至最低，之后出現(xiàn)反彈，最終的感染率約17%（如圖1），明顯低于生理鹽水組（P＜0．05）。

圖1 各組沙眼衣原體感染率的變化趨勢Fig．1The tendency of chlamydial trachomatis infection rate in different groups

3．小鼠生殖道組織病理改變

如圖1所示，對照組子宮和陰道黏膜上皮細胞排列密集，形態(tài)正常，間質(zhì)無充血水腫，腔內(nèi)無滲出物（圖3A和3D）。生理鹽水組子宮黏膜上皮脫落，間質(zhì)充血水腫，腔內(nèi)可見少量滲出物，說明沙眼衣原體上行感染子宮（圖3B）；陰道黏膜存在明顯的炎癥表現(xiàn)，細胞形態(tài)紊亂，間質(zhì)細胞增生、血管擴張，腔內(nèi)有細胞滲出（圖3E）。阿奇霉素組子宮黏膜結(jié)構(gòu)正常（圖3C）；陰道黏膜上皮細胞染色較深，細胞體積較小，排列密集，間質(zhì)未見血管擴張，腔內(nèi)未見滲出物。黏膜內(nèi)亦可見大量的未分化細胞（圖3F）。

4．陰道和子宮頸黏膜肥大細胞和樹突狀細胞的分布

生殖道的黏膜免疫是重要的防御屏障，生理狀態(tài)下，子宮和陰道黏膜內(nèi)存在肥大細胞（圖4A）和樹突狀細胞（圖4D）。微生物的感染不僅會引起正常組織結(jié)構(gòu)的破壞，也會造成黏膜微環(huán)境的改變。在生理鹽水組的生殖道黏膜內(nèi)，肥大細胞和樹突狀細胞的數(shù)量較對照組明顯增加（表1；圖4B和E）。阿奇霉素組黏膜內(nèi)的肥大細胞數(shù)量與對照組無明顯差異（表1；圖4C）；樹突狀細胞的數(shù)量較生理鹽水組明顯增加（表1；圖4F）。水組比較，P＜0．05。△：Compared with Control group，P＜0．05．

表1 阿奇霉素治療后小鼠生殖道黏膜肥大細胞和樹突狀細胞數(shù)量Table 1 The amount of mast cells and dendritic cells in the mucosa of mice genital tract after azithromycin treatment（ˉx±s）

5．血清免疫因子IL－6和TNF－α濃度

感染沙眼衣原體后，小鼠血清IL－6的濃度均較正常組升高；阿奇霉素治療后，小鼠血清中高濃度的IL－6持續(xù)時間較生理鹽水組長（P＜0．05）（如圖2）。TNF－α的濃度在阿奇霉素治療組濃度較對照組和生理鹽水組升高，且持續(xù)時間長。

圖2 阿奇霉素治療后小鼠血清IL－6和TNF－α濃度（±s）Fig．2The concentration of serum IL－6and TNF－αafter azithromycin treatment．

討 論

生殖道沙眼衣原體感染后機體所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，包括由巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞和肥大細胞等參與的非特異性免疫反應(yīng)和由CD4＋和CD8＋細胞介導(dǎo)的黏膜免疫反應(yīng)。目前認為，沙眼衣原體感染所產(chǎn)生的免疫病理反應(yīng)是導(dǎo)致嚴(yán)重并發(fā)癥的主要原因，而這種免疫病理反應(yīng)的機制是Th1／Th2比例失調(diào)［7］：在清除機體沙眼衣原體感染時，CD4＋T細胞和IFN－γ發(fā)揮了重要的作用；然而CD8＋T細胞。

1．阿奇霉素對黏膜局部免疫細胞的影響

肥大細胞是機體抗感染免疫的第一線細胞。大多情況下，肥大細胞執(zhí)行免疫防御的功能，但也可對宿主造成損傷。肥大細胞在沙眼衣原體感染后的生殖道持續(xù)增多，通過分泌細胞因子IL－4，誘導(dǎo)CD4＋T淋巴細胞向Th2細胞方向轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致生殖道黏膜內(nèi)Th1／Th2比例失調(diào)，加重黏膜免疫病理損傷［8］。給予阿奇霉素治療后，生殖道黏膜的肥大細胞數(shù)量與對照組無顯著性差異，提示黏膜局部的免疫病理損傷程度較輕。

生殖道黏膜內(nèi)存在的CD11＋的樹突狀細胞，不僅能提呈抗原，并與CD4＋細胞發(fā)生抗原依賴性聚集，引發(fā)T、B細胞的增殖分化和一系列免疫反應(yīng)。樹突狀細胞的數(shù)量和功能狀態(tài)可一定程度反映機體免疫機能。阿奇霉素治療組的小鼠，生殖道黏膜內(nèi)的樹突狀細胞數(shù)量明顯增加，勢必激發(fā)Th1型免疫反應(yīng)，有效的控制感染，減輕病理損傷［9］。

阿奇霉素治療后，子宮和陰道黏膜形態(tài)基本正常；肥大細胞數(shù)量無明顯變化；樹突狀細胞的數(shù)量增加，均說明生殖道黏膜內(nèi)感染得到有效控制、免疫病理損傷減輕。

2．阿奇霉素對血清內(nèi)細胞因子的影響

陰道、宮頸、輸卵管上皮、子宮內(nèi)膜上皮和基質(zhì)細胞都有抗原提呈功能［10］，并可以分泌多種生物活性物質(zhì)和細胞因子參與和調(diào)節(jié)黏膜免疫反應(yīng)，IL－6就是其中一種［11］。IL－6是 Th2細胞因子，可促進Th2細胞的增殖和分化［12］。TNF－α是Th1細胞因子，可以促進Th1型細胞的增殖和分化。本研究結(jié)果顯示生理鹽水組的小鼠，血清內(nèi)IL－6濃度升高，TNF－α的濃度無明顯改變，導(dǎo)致Th1／Th2比例失衡。阿奇霉素治療后，血清IL－6濃度升高，同時，血清內(nèi)TNF－α濃度亦升高，有助于維持Th1／Th2比例平衡。TNF－α在沙眼衣原體感染中的作用目前尚無定論。最近有研究報道TNF－α基因敲除的小鼠亦能順利清除沙眼衣原體的感染，并且上行性感染的發(fā)生率較野生型小鼠降低。提示TNF－α在機體對抗沙眼衣原體的感染中，不僅不是必須的，而且有可能增加病理損傷［13］。本研究結(jié)果提示阿奇霉素治療后TNF－α濃度升高，有助于治愈沙眼衣原體感染。因此，沙眼衣原體的清除是多種細胞和細胞因子協(xié)同作用的結(jié)果，盡管某種細胞因子的作用可能不是必須的，但是卻不能否認其在感染過程中發(fā)揮的作用。

根據(jù)目前的研究結(jié)果，我們認為阿奇霉素使用后，能有效的清除病原體，同時通過影響細胞因子的分泌，誘導(dǎo)樹突狀細胞等抗原呈遞細胞在生殖道黏膜聚集、合成與分泌細胞因子，減輕黏膜免疫病理損傷，保證了黏膜的完整性。阿奇霉素使用后，對黏膜內(nèi)細胞結(jié)構(gòu)和功能的影響機制，有待于我們進一步研究。

［1］World Health Organization．Prevention and control of sexually transmitted infections：draft global strategy．［http：／／www．who．int］．WHO，2006

［2］Johnson RM．Murine oviduct epithelial cell cytokine responses to Chlamydia muridarum infection include interleukin－12－p70secretion．Infect Immun，2004，72（7）：3951－3960

［3］Thomson NR，Clarke IN．Chlamydia trachomatis：small genome，big challenges．Future Microbiol，2010，5（4）：555－561

［4］Srivastava P，Jha HC，Salhan IN，et al．Azithromycin treatment modulates cytokine production in Chlamydia trachomatis infected women．Basic Clin Pharmacol Toxicol，2009，104（6）：478－482

［5］Peric A，Vojvodic D，Baletic N，et al．Influence of allergy on the immunomodulatory and clinical effects of long－term low－dose macrolide treatment of nasal polyposis．Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub，2010，154（4）：327－333

［6］Tuffrey M，Woods C，Inman C，et al．The effect of a single oral dose of azithromycin on chlamydial infertility and oviduct infrastructure in mice．Journal of Antimicrobial Chemotherapy，1994，34，989－999

［7］O＇Meara CP，Armitage CW，Harvie MC，et al．Immunization with a MOMP－Based Vaccine Protects Mice against a Pulmonary Chlamydia Challenge and Identifies a Disconnection between Infection and Pathology．PLoS ONE，2013，8（4）：e61962

［8］王燕舞，孟運蓮，羅善云等．肥大細胞在大鼠輸卵管急性沙眼衣原體感染中的作用。中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)雜志，2002，11（2）：205－207

［9］LüH，Wang H，Zhao HM，et al．Dendritic cells（DCs）transfected with a recombinant adenovirus carrying chlamydial major outer membrane protein antigen elicit protective immune responses against genital tract challenge infection．Biochem Cell Biol，2010，88（4）：757－765

［10］Ochiel DO，Rossoll RM，Schaefer TM，et al．Effect of oestradiol and pathogen ‐ associated molecular patterns on class II‐ mediated antigen presentation and immunomodulatory molecule expression in the mouse female reproductive tract．Immunology，2012，135（1）：51－62

［11］Wira CR，F(xiàn)ahey JV，Ghosh M，et al．Sex Hormone Regulation of Innate Immunity in the Female Reproductive Tract：The Role of Epithelial Cells in Balancing Reproductive Potential with Protection against Sexually Transmitted Pathogens．American Journal of Reproductive Immunology，2010，63（6）：544－565

［12］Sze HoL，He Q，Chen J，et al．Interaction between endometrial epithelial cells and blood leucocytes promotes cytokine release and epithelial barrier function in response to Chlamydia trachomatis lipopolysaccharide stimulation．Cell Biol Int．2010，34（9）：951－958

［13］Kamalakaran S，Chaganty BK，Gupta R，et al．Vaginal chlamydial clearance following primary or secondary infection in mice occurs independently of TNF－α．Front Cell Infect Microbiol，2013，3：11

圖3 阿奇霉素治療后生殖道沙眼衣原體感染小鼠陰道和子宮組織病理變化．HE×400A：對照組小鼠子宮；B：生理鹽水組小鼠子宮；C：阿奇霉素組小鼠子宮；D：對照組小鼠陰道；E：生理鹽水組小鼠陰道；F：阿奇霉素組小鼠陰道Fig．3Histopathology of uteri and vaginae of mice infected with Chlamydial trachomatis following administration with azithromycin．HE×400A．Uterus of Control group；B．Uterus of Saline group；C．Uterus of Azithromycin group；D．Vaginal of Control group；E．Vaginal of Saline group；F．Vaginal of Azithromycin group

圖4 阿奇霉素治療后生殖道沙眼衣原體感染小鼠黏膜肥大細胞和樹突狀細胞的分布．SABC×200A：對照組肥大細胞；B：生理鹽水組肥大細胞；C：阿奇霉素組肥大細胞；D：對照組樹突狀細胞；E：生理鹽水組樹突狀細胞；F：阿奇霉素組樹突狀細胞Fig．4The distribution of mast cells and dendritic cells in the mucosa of the mouse genital tract after azithromycin treatment．SABC×200A．Mast Cells of Control group；B．Mast Cells of Saline group；C．Mast Cells of Azithromycin group；D．Dendritic cells of Control group；E．Dendritic cells of Saline group；F．Dendritic cells of Azithromycin group