張鵬幸,許 靜,盧劍功,王 偉

(山西大學(xué)生物技術(shù)研究所,化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 太原030006)

環(huán)境中的重金屬污染不能被微生物有效降解,并會通過食物鏈的生物積累作用富集.幾乎所有的重金屬都能對生物體產(chǎn)生毒害作用[1-2].對重金屬的有效監(jiān)測是對環(huán)境保護(hù)和人類健康安全保障的重要手段.理化監(jiān)測方法在環(huán)境監(jiān)測中起到重要的作用,但是這些方法不能區(qū)別重金屬在生物系統(tǒng)中的有效作用部位和有效評價(jià)環(huán)境中重金屬的生物利用度及遺傳毒性.生物測試和生物傳感器克服和補(bǔ)充理化監(jiān)測的不足,已發(fā)展為評估重金屬污染的有效工具.生物監(jiān)測既可評價(jià)污染物的遺傳毒性,也可針對金屬離子的有效作用部位進(jìn)行檢測.通過觀察斑馬魚胚胎發(fā)育,評價(jià)了納米碳化鎢和1,2,4-三氯苯的水生態(tài)毒理效應(yīng)[3-4].全細(xì)胞生物傳感器(Whole Cell Biosensor,WCB)可以特異性的對金屬離子的刺激產(chǎn)生應(yīng)激,并將信號放大,反應(yīng)靈敏,監(jiān)測快速,已發(fā)展為一種重要的生物監(jiān)測手段[5].

纖毛類原生動(dòng)物是單細(xì)胞真核生物,沒有細(xì)胞壁,對環(huán)境污染具有很高的敏感性,具有對環(huán)境污染更快的響應(yīng)機(jī)制[6].纖毛類原生動(dòng)物用于環(huán)境污染檢測的方式有2種類型：“turn off”和“turn on”[7].在“turn off”試驗(yàn)中,基于生長速率、發(fā)光度、細(xì)胞群落的色度等的降低,對細(xì)胞活性抑制水平進(jìn)行檢測.嗜熱四膜蟲突變體生產(chǎn)過剩的黑色素前體成功檢測霉菌毒素[8].在“turn on”試驗(yàn)中,一個(gè)可定量的分子報(bào)告元件與一個(gè)特定的基因啟動(dòng)子連接,當(dāng)受到環(huán)境污染物刺激后,細(xì)胞能夠做出快速響應(yīng)[8-10].金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子能夠?qū)Χ喾N重金屬做出快速、靈敏的應(yīng)激反應(yīng).在嗜熱四膜蟲中,MTT1和MTT3基因的啟動(dòng)子對鎘離子的響應(yīng)敏感,MTT2和MTT4基因的啟動(dòng)子對銅離子的響應(yīng)敏感,而MTT5基因的啟動(dòng)子對汞離子的響應(yīng)敏感[11],所以它們能夠用于構(gòu)建不同類型的WCB.熒光素酶因其容易被檢測而廣泛的用作報(bào)告系統(tǒng)[5].

本研究為了獲得可以快速檢測重金屬的WCB,以嗜熱四膜蟲為材料,構(gòu)建了一種含有螢火蟲熒光素酶基因的重組四膜蟲WCB,并檢測了該細(xì)胞株對重金屬鎘、汞、銅和鋅的響應(yīng).

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株和質(zhì)粒

嗜熱四膜蟲(T.thermophila)B2086細(xì)胞株(美國康奈爾大學(xué)Peter J.Bruns博士惠贈);質(zhì)粒pBX(羅徹斯特大學(xué)Martin A.Gorovsky教授惠贈),含有HA標(biāo)簽、MTT1啟動(dòng)子、微管蛋白終止子及巴龍霉素抗性基因neo2;大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α為本實(shí)驗(yàn)室自行保存,pEASY-T1 Vector購于全式金公司;質(zhì)粒pGL3-control購自Promega公司.

1.2 試劑和儀器

DNA回收試劑盒(BioFlux公司);質(zhì)粒抽提試劑盒(BioOMEGA公司);TaqDNA聚合酶和核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)(北京TIANGEN公司);PCR引物合成和DNA序列測定由TAKARA公司完成;蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉和瓊脂(上海Sangon公司);氨芐青霉素(華美生物工程公司);螢火蟲熒光素酶檢測試劑盒E1500(Promega公司);SPP培養(yǎng)基所用示蛋白胨、葡糖糖、酵母提取物、乙二胺四乙酸鈉鹽(Oxoid公司);青霉素、鏈霉素、兩性霉素(華北制藥公司).anti-HA抗體(Cali-Bio公司);HRP標(biāo)記二抗(Zymed Lab公司);SuperSignal顯色液(Pierce公司);GJ-100高壓氣體基因槍(寧波新芝生物科技公司);GloMaxTM 20/20熒光檢測儀(Promega公司).

1.3 方法

分別對pEASY-T1-LUC和載體pBX進(jìn)行BamH I酶切和AscI雙酶切,回收酶切產(chǎn)物中的目的片段LUC和目的載體,按比例混合后用T4 DNA連接酶16℃過夜連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5а感受態(tài)細(xì)胞,在含氨芐霉素的LB固體培養(yǎng)基37℃過夜培養(yǎng),挑取單菌落在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),提取質(zhì)粒BamH I和XhoI酶切鑒定.

1.3.2 嗜熱四膜蟲的培養(yǎng)及饑餓 嗜熱四膜蟲B2086培養(yǎng)在50mL SPP培養(yǎng)液中,生長條件為30℃,180r/min振蕩培養(yǎng);當(dāng)四膜蟲生長至對數(shù)生長期(2.0×105～5.0×105個(gè)/mL)時(shí),10mmol/L Tris-HCl(pH7.4)洗滌1次,并于50mL 10mmol/L Tris-HCl(pH7.4)中饑餓 18～24h.

1.3.3 四膜蟲B2086-LUC的構(gòu)建及鑒定 構(gòu)建好的中間載體pBX-LUC用XhoⅠ酶切線性化,并用乙醇純化濃縮后,包裹在金顆粒上,通過GJ-1000基因槍轉(zhuǎn)入饑餓18～24h的嗜熱四膜蟲B2086中[12-13],4h后加入巴龍霉素(終濃度為100μg/mL)和 CdCl2(終濃度為 0.5μg/mL),分裝到96孔板中,30℃恒溫培養(yǎng)3d后,逐步增加巴龍霉素濃度,LUC基因重組入MTT1位點(diǎn)并逐步取代MTT1基因(圖1).

圖1 載體pBX-LUC與四膜蟲大核基因組同源重組示意Fig.1 Schematic diagram of recombination between plasmid pBX-LUC and Tetrahymena macronulear genome

提取嗜熱四膜蟲基因組,設(shè)計(jì)引物MTT1F：5′GCTACGTGATTCACGATTTATGCAATG 3′,MTT1R：5′CGAAACTGATTTTATGCAATTAT GAATTAC 3′,PCR擴(kuò)增鑒定基因的重組效果.

1.3.4 HA-LUC蛋白的免疫印跡法分析 PCR鑒定LUC正確重組的四膜蟲細(xì)胞在含0,0.1μg/mL鎘的 SPP培養(yǎng)基中培養(yǎng)至濃度為(2～3)×105個(gè)/mL.收集樣品 2×104個(gè)細(xì)胞并加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液(5%β-巰基乙醇,50%甘油,10%SDS和250mmol/L Tris-HCl,pH6.8)后金屬浴 95℃加熱 5min.將樣品在 10%SDSPAGE凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫封閉2h,1：500稀釋的anti-HA抗體4℃孵育過夜,1：500稀釋的HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1h.經(jīng)SuperSignal化學(xué)發(fā)光底物顯色液顯色3min后檢測.

1.3.5 四膜蟲B2086-LUC對不同重金屬的響應(yīng) 野生型四膜蟲和B2086-LUC培養(yǎng)在50 mL SPP培養(yǎng)液中,生長條件為30℃,180r/min振蕩培養(yǎng).當(dāng)四膜蟲生長至對數(shù)生長期(2.0×105～5.0×105個(gè)/mL)時(shí)饑餓在 10mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)后立即分裝5mL/管,分別用終濃度為0,0.001,0.005,0.01,0.05,0.1,0.5μg/mL 的 CdCl2;0,0.000 5,0.001,0.01,0.05,0.1,0.2μg/mL 的 HgSO4;0,0.25,1,1.25,2,2.5,5mg/mL的CuCl2;0,0.25,1,1.25,2,2.5,5mg/mL的ZnSO4誘導(dǎo)3h.取樣后血球計(jì)數(shù)板記數(shù)3次取平均值;每組樣品分別取2×105個(gè)細(xì)胞于滅菌后的1.5mL EP管中,平行對照3組;8000r/min離心5min后,棄盡上清,加入200μL裂解液,重懸混勻;取100μL樣品于新的EP管中,同時(shí)加入100μL螢火蟲熒光素酶底物,熒光檢測儀檢測并記錄熒光值,受試樣品3次計(jì)數(shù)取平均值,計(jì)算樣品組與對照組熒光值的倍數(shù)關(guān)系,并繪制熒光值變化倍數(shù)-受試樣品濃度關(guān)系.

2 結(jié)果

2.1重組質(zhì)粒pBX-LUC的鑒定

以克隆載體pGL3-control為模板,擴(kuò)增螢火蟲熒光素酶基因LUC,瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn),PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期相符(圖2A).將PCR產(chǎn)物連接到載體pBX上,重組質(zhì)粒pBX-LUC經(jīng)BamH I和XhoI雙酶切后,得到大小分別為7kb的載體片段和2.2kb的含有目的基因LUC的片段(圖2B),重組質(zhì)粒pBX-LUC的LUC測序結(jié)果與已報(bào)道的LUC基因序列進(jìn)行比對,確證本研究克隆的LUC基因序列正確,表明重組質(zhì)粒pBX-LUC構(gòu)建成功.

圖2pBX-LUC載體的鑒定Fig.2 Identification of plasmid pBX-LUC

2.2 四膜蟲B2086-LUC的鑒定

酶切、濃縮的pBX-LUC轉(zhuǎn)化四膜蟲B2086細(xì)胞,經(jīng)同源重組,LUC序列替代大核基因組上MTT1序列(圖3A),在不斷增加的巴龍霉素濃度下,基因組MTT1序列被LUC逐步替代.挑取在200μg/mL巴龍霉素下存活的B2086細(xì)胞株單克隆,擴(kuò)大培養(yǎng)后提取基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定,陽性細(xì)胞株有2條擴(kuò)增產(chǎn)物,750bp為四膜蟲大核基因組MTT1基因序列,2000bp為含有LUC基因序列(圖3A),結(jié)果表明LUC基因序列部分替代了大核MTT1基因序列,從而證實(shí)含有LUC的重組四膜蟲B2086-LUC構(gòu)建成功.

圖3 四膜蟲pBX-LUC細(xì)胞株的鑒定Fig.3 Identification of Tetrahymena B2086-LUC strains

收集PCR鑒定為陽性的B2086-LUC細(xì)胞株并提取總蛋白,免疫印跡檢測HA-LUC蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示,HA-LUC蛋白分子量大小約為62.82kDa,與軟件預(yù)測分子量大小相符,而在未經(jīng)重金屬誘導(dǎo)的細(xì)胞株中沒有出現(xiàn)任何特異性條帶(圖3B),表明HA-LUC蛋白在四膜蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá).

2.3 四膜蟲B2086-LUC對重金屬的監(jiān)測

熒光素酶基因是一種重要的報(bào)告基因,在應(yīng)激物誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)產(chǎn)生螢火蟲熒光素酶,螢火蟲熒光素酶可以催化熒光素氧化成氧化熒光素,在熒光素氧化的過程中,會發(fā)出生物熒光,然后可以通過熒光測定儀測定熒光素酶催化釋放的生物熒光.重組四膜蟲B2086-LUC對鎘誘導(dǎo)的響應(yīng)濃度范圍為：0.001～0.5μg/mL,峰值為 19891 倍且對應(yīng)的濃度為0.1μg/mL(圖4A);對汞誘導(dǎo)的響應(yīng)范圍為：0.0005～0.2μg/mL,峰值為 1746 倍且對應(yīng)的濃度為0.05μg/mL(圖4B);對銅誘導(dǎo)的響應(yīng)范圍為：0.25～5mg/mL,峰值為2606倍且對應(yīng)的濃度為2.5mg/mL(圖4C);對鋅誘導(dǎo)的響應(yīng)范圍為：0.1～5mg/mL,峰值為19463倍且對應(yīng)的濃度為2mg/mL(圖4D).結(jié)果說明以四膜蟲MTT1基因的啟動(dòng)子啟動(dòng)報(bào)告基因螢火蟲熒光素酶的表達(dá),可以檢測多種應(yīng)激物的表達(dá),其中對非必需重金屬鎘、汞最敏感,銅和鋅次之.

3 討論

MT基因在環(huán)境中存在重金屬時(shí)的可誘導(dǎo)性使其可作為一種良好的報(bào)告基因.因此,MTs被歐盟列入生物標(biāo)記物并用于環(huán)境評估項(xiàng)目中,其中一種途徑是直接檢測MT轉(zhuǎn)錄或蛋白表達(dá)水平,另一種有效途徑是將金屬誘導(dǎo)型啟動(dòng)子組裝到報(bào)告基因前,從而構(gòu)建一個(gè)新的轉(zhuǎn)基因生物用于發(fā)揮WCB的功能[14-15].類似于其他生物中,四膜蟲暴露在金屬環(huán)境中時(shí)MT基因被優(yōu)先誘導(dǎo)表達(dá)[11,16].嗜熱四膜蟲金屬硫蛋白基因MTT1啟動(dòng)子能夠被多種重金屬離子誘導(dǎo),因此能夠作為潛在的環(huán)境污染物的應(yīng)答元件[9].

迄今為止,85%的用于檢測重金屬的WCBs是基于遺傳學(xué)改造的細(xì)菌[15],而15%是基于真核生物[17],分別是釀酒酵母、多形漢遜酵母及四膜蟲[5,18-19].大多數(shù)WCBs只能響應(yīng)2種或多種金屬,而且有些表現(xiàn)出較強(qiáng)的特異性[20-22].其中以重組釀酒酵母為WCB可用于檢測樣品中的銅污染,最低可檢測到0.5μmol/L[19].以重組多形漢遜酵母為載體的WCB主要用于檢測環(huán)境中的有毒重金屬的污染,尤其是鎘污染[18].以四膜蟲為載體構(gòu)建的WCB是通過基因重組將螢火蟲熒光素酶基因取代BTU2基因,并利用MTT1和MTT5基因啟動(dòng)子的多重響應(yīng)機(jī)制,在生長環(huán)境中含有重金屬等應(yīng)激因素時(shí),細(xì)胞能夠定量檢測環(huán)境中的污染指數(shù),對非必需重金屬(鎘,鉛,砷和汞)的可檢測的最低濃度約為25～50nmol/L,而必須金屬(如銅和鋅)的可檢測的最低濃度約為1μmol/mL[5].本研究獲得的重組四膜蟲細(xì)胞株B2086-LUC對鎘、汞也表現(xiàn)出很強(qiáng)的響應(yīng),可響應(yīng)的最低濃度為5～10ng/mL,與已報(bào)道的四膜蟲WCB的敏感性相近[5].但是本研究將LUC基因取代MTT1基因,而不是四膜蟲生長必需的微管蛋白,一方面削弱了MTT1原本的解毒反應(yīng),另一方面在不破壞四膜蟲微管正常發(fā)育的情況下,實(shí)現(xiàn)重組細(xì)胞株對重金屬鎘和汞的高敏感性.另外MTT1基因啟動(dòng)子在細(xì)胞正常的生理狀態(tài)下,幾乎沒有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的出現(xiàn),而MTT2和MTT4在生理狀態(tài)下有較高的表達(dá)水平,因此MTT1基因啟動(dòng)子的選擇有效的減少了熒光的背景信息.B2086-LUC細(xì)胞株對銅和鋅的響應(yīng)稍弱,說明其對不同重金屬的誘導(dǎo)表現(xiàn)出差異,這與MTT1基因的啟動(dòng)子對不同重金屬的敏感性一致.通過多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)證明了B2086-LUC細(xì)胞株的穩(wěn)定性及對重金屬污染檢測結(jié)果的可重復(fù)性.

圖4 B2086-LUC四膜蟲細(xì)胞株對不同重金屬離子的響應(yīng)Fig.4 The response to different heavy metal ions in Tetrahymena B2086-LUC cell

獲得WCB后用于檢測環(huán)境污染物,除了需要特定的基因外,它還依賴于測定介質(zhì)和暴露于誘導(dǎo)物中的時(shí)間,以及細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)如培養(yǎng)濃度和生長階段等因素,因此建立標(biāo)準(zhǔn)化的操作是必需的.本研究中,重組四膜蟲B2086-LUC培養(yǎng)到對數(shù)生長期(2.0×105～5.0×105個(gè)/mL),饑餓在10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)后立即分裝,加入不同濃度的不同受測樣品誘導(dǎo)3h,這與已報(bào)道的四膜蟲WCB的檢測方法相似[5].WCB的一個(gè)潛在的缺陷是在檢測高毒性的樣品時(shí),使細(xì)胞喪失生存能力并導(dǎo)致假陰性結(jié)果的產(chǎn)生,這些樣品不僅抑制誘導(dǎo)表達(dá),也同時(shí)抑制了報(bào)告基因的本底表達(dá),本研究通過稀釋樣品恢復(fù)本底和誘導(dǎo)反應(yīng),從而實(shí)現(xiàn)有效檢測.因此,系列稀釋誘導(dǎo)的WCB的熒光表達(dá)不僅可以用于檢測高毒性樣品引起的假陰性,還可以用于識別潛在的假陽性.本研究中的工程化細(xì)胞株基于MTT1基因的啟動(dòng)子對一些重金屬離子(如鎘,汞)具有的偏愛性,因而具有特定的監(jiān)測優(yōu)勢.因此重組螢火蟲熒光素酶的四膜蟲B2086-LUC可望作為一種良好的環(huán)境污染監(jiān)測工具用于環(huán)境中鎘、汞的快速監(jiān)測.

4 結(jié)論

4.1 重組過表達(dá)載體pBX-LUC成功構(gòu)建,其中含有LUC基因,MTT1基因啟動(dòng)子,HA標(biāo)簽,neo2抗性基因.

4.2 構(gòu)建含有LUC的WCB重組四膜蟲B2086-LUC細(xì)胞株,LUC基因部分取代MTT1基因,在重金屬誘導(dǎo)下LUC蛋白特異表達(dá).

4.3 B2086-LUC對重金屬鎘和汞的響應(yīng)最敏感,可檢測的最低濃度為5～10ng/mL;對銅和鋅的響應(yīng)較弱,可檢測的最低濃度為0.5～1mg/mL.

[1]Kong I C,Bitton G,Koopman B,et al.Heavy metal toxicity testing in environmental samples[J].Rev.Environ.Contam.Toxicol.,1995,142：119-147.

[2]Leonard S S,Harris G K,Shi X.Metal-induced oxidative stress and signal transduction [J].Free Radic Biol.Med.,2004,37(12)：1921-1942.

[3] 王利鳳,郭鳳華,楊 卓.納米碳化鎢對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響 [J].中國環(huán)境科學(xué),2012,32(7)：1280-1283.

[4] 杜青平,劉伍香,袁保紅,等.1,2,4一三氯苯對斑馬魚生殖和胚胎發(fā)育毒性效應(yīng) [J].中國環(huán)境科學(xué),2012,32(4)：736-741.

[5] Amaro F,Turkewitz A P,Martin-Gonzalez A,et al.Whole-cell biosensors for detection of heavy metal ions in environmental samples based on metallothionein promoters fromTetrahymena thermophila[J].Microb.Biotechnol.,2011,4(4)：513-522.

[6] Gutiérrez J C,Gonzalez A M,Díaz S,et al.Ciliates as a potential source of cellular and molecular biomarkers/biosensors for heavy metal pollution[J].Eur.J.Protistol.,2003,39(4)：461-467.

[7] Belkin S.Microbial whole-cell sensing systems of env-ironmental pollutants[J].Curr.Opin.Microbiol.,2003,6(3)：206-212.

[8]Cole E S,Anderson P C,Fulton R B,et al.A proteomics approach to cloning fenestrin from the nuclear exchange junction ofTetrahymena[J].J.Eukaryot Microbiol.,2008,55(4)：245-256.

[9]Shang Y,Song X,Bowen J,etal.A robust inducible-repressible promoter greatly facilitates gene knockouts,conditional expression,and overexpression of homologous and heterologous genes inTetrahymena thermophila[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2002,99(6)：3734-3739.

[10]Wloga D,Strzyzewska-Jowko I,Gaertig J,et al.Septins stabilize mitochondria inTetrahymena thermophila[J].Eukaryot Cell,2008,7(8)：1373-1386.

[11]Diaz S,Amaro F,Rico D,etal.Tetrahymenametallothioneins fall into two discrete subfamilies[J].PLoS One,2007,2(3)：e291.

[12]Gaertig J,Gu L,HaiB,etal.High frequency vector-mediated transformation and gene replacement inTetrahymena[J].Nucleic.Acids.Res.,1994,22(24)：5391-5398.

[13]Gaertig J,KaplerG.Transientand stable DNA transformation ofTetrahymenathermophila by electroporation[J].Methods Cell Biol.,2000,62：485-500.

[14]Hynninen A,Virta M.Whole-cell bioreporters for the detection ofbioavailablemetals[J].Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.,2010,118：31-63.

[15]Magrisso S,Erel Y,Belkin S.Microbial reporters of metal bioavailability[J].Microb.Biotechnol.,2008,1(4)：320-330.

[16]Dondero F,Cavaletto M,Ghezzi A R,et al.Biochemical characterization and quantitative gene expression analysis of the multi-stress inducible metallothionein fromTetrahymena thermophila[J].Protist,2004,155(2)：157-168.

[17]Richard M,Walmsley P K.The Eukaryote Alternative：advantages of using yeasts in place of bacteria in microbial biosensor development[J].Biotechnol.Bioprocess Eng.,2000,5：387-394.

[18]Park J N,Sohn M J,Oh D B,et al.Identification of the cadmium-inducible Hansenula polymorpha SEO1 gene promoter by transcriptome analysis and its application to whole-cell heavy-metal detection systems[J].Appl.Environ.Microbiol.,2007,73(19)：5990-6000.

[19]Ranjit S,Shetty S K D,Liu Y,et al.Fluorescence based sensing system for copper using genetically engineered living yeast cells[J].Biotechnology and Bioengineering,2004,88(5)：664-670.

[20]Tom-Petersen A,Hosbond C,Nybroe O.Identification of copper-induced genes inPseudomonas fluorescensand use of a reporter strain to monitor bioavailable copper in soil[J].FEMS Microbiology Ecology,2001,38(1)：59-67.

[21]Corbisier P,van der Lelie D,Borremans B,et al.Whole cell- and protein-based biosensors for the detection of bioavailable heavy metals in environmentalsamples [J].Analytica Chimica Acta,1999,387(3)：235-244.

[22]Ivask A,Rolova T,Kahru A.A suite of recombinant luminescent bacterial strains for the quantification of bioavailable heavy metals and toxicity testing [J].BMC Biotechnol.,2009,9(1)：41.

致謝：重組四膜蟲的構(gòu)建由王清路博士及梁海霞博士協(xié)助指導(dǎo)完成,在此表示感謝.